Anti-CD3 scFv-B7.1真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的初步表达

目的　构建anti CD3scFv B7.1真核表达载体 ,并进行初步表达。方法　采用重叠延伸拼接法 (splicingbyoverlapextention ,SOE)将anti CD3scFv和B7.1(V +C)两个基因片段通过spacer序列连接 ,将融合基因克隆入T载体 ,并测序证实。在此基础上构建真核表达载体pcDNA/anti CD3scFv B7.1,并经脂质体法转染COS 7细胞 ,免疫组织化学法检测表达。结果　获得了序列与预期完全相同的融合基因 ;构建了抗CD3scFv B7.1融合基因真核表达载体 ;在COS 7细胞中获得初步表达。结论　成功构建及表达抗CD3scFv B7.1融合基因真核表达载体 ,为进一步研究抗CD3scFv B7.1双功能分子的生物学活性及用于肿瘤生物治疗奠定了基础     

血小板生成素基因的克隆及在原核细胞的表达

目的　克隆人血小板生成素 (hTPO)基因 ,并使其在原核细胞中获得表达。方法　先从人胚胎肝脏中提取总RNA ,进行RT -PCR获得编码氨基端 1 95个氨基酸残基的hTPO1 95cDNA。将该片段亚克隆至pGEM -Teasy克隆质粒中 ,以双脱氧链末端终止法对克隆质粒直接测序。接着将hTPO1 95cDNA插入到原核表达质粒 pET2 8-a中 ,转化大肠杆菌BLR2 1 (DE3) ,进行诱导表达 ,以SDS -PAGE方法及免疫印迹法进行检测。结果　得到的hTPO1 95cDNA与文献报道的序列完全一致。经诱导后hTPO基因在大肠杆菌中获得表达 ,目的蛋白占总菌体蛋白约 1 0 % ,以免疫印迹法证实表达产物正确。结论　得到hTPO1 95cDNA ,并在原核细胞中获得表达 ,得到截短形式的rhT PO1 95。     

利用裸B_(7.1)cDNA免疫建立分泌单抗的杂交瘤细胞株

B7.1是诱导抗原特异性T细胞活化的一个重要共刺激分子，在肿瘤免疫、移植免疫、维持自身免疫及生理自稳中有重要作用。深入研究B71分子功能结构是阐明其调节T细胞活化机制，正确合理使用B7.1及其类缘分子治疗人体疾病的必要前提。B7.1抗体，尤其是抗B7.1分子亚区的抗体是进行这种研究必不可少的工具。目前市售的B；；抗体，仅与B7.1分子的一个表位反应，不利于进行B7.1抗原功能结构域的分析，有文献报道，现用的制备抗B7.1方法很难获得抗B7.1其它表位的抗体。而使用裸DNA免疫，能使宿主组织细胞长期持续表达其编码蛋白产物，并以天然…     

人GLUT4基因的克隆及原核表达的初步实验研究

目的　通过反转录聚合酶链方法 ,从人新鲜手术肌肉组织获得人葡萄糖转运子 4 (GLUT4 )cDNA基因 ,并分别克隆入测序载体、表达载体 ,获得具有正确序列的目的基因及其原核表达产物 ,为其进一步的抗体制备、活性鉴定及研究应用奠定物质基础。方法　经GenBank在线检索 ,设计、确定人GLUT4cDNA基因特异引物 ,采用反转录聚合酶链 (RT PCR)方法从一例手术的人新鲜腹部肌肉组织总RNA模板中 ,获得人GLUT4表达片段cDNA的基因 ,经克隆入测序载体pGEM 3zf(- )测序 ,验证cDNA大小、完整性及序列。再克隆入表达载体 pBV2 2 0 ,经温度诱导 ,在E .coli获得表达。结果　以设计的特异引物 ,从人肌肉组织模板中能得到预期大小完整的人GLUT4cDNA基因 ,并能插入预定的克隆载体中测序 ,所得基因的序列与目的基因的序列相符。所获GLUT4cDNA基因插入原核非融合表达载体pBV2 2 0 ,获得预期大小的重组表达产物。结论　从人肌肉组织中能获得具有正确序列、含完整起始及终止密码的人GLUT4cDNA基因。该人GLUT4cDNA基因的体外重组体能在原核表达系统表达     

B7.1胞外编码区的真核表达及其生物活性

目的　真核表达B7.1细胞外编码区以研究其生物学活性。方法　电穿孔法将重组质粒pDisplay/B7.1(V +C)导入人子宫颈癌细胞株 ,免疫组化及核酸原位杂交法分别检测其蛋白及mRNA表达 ,3 H TdR掺入法测定表达物对T细胞的刺激作用 ;MTT法研究转染细胞 T细胞混合培养引发的细胞毒性杀伤作用。结果　B7.1细胞外区在Hela细胞表面表达 ,所表达的B7.1细胞外区在抗CD3单抗存在的情况下具有刺激T细胞活化的特性 ,重组质粒转染的Hela细胞与T细胞混合培养可引起细胞毒性杀伤。结论　真核表达的B7.1(V +C)具有T细胞共刺激活性 ,可用于构建肿瘤免疫治疗之双功能分子。     

用RT—PCR扩增人谷胱甘肽过氧化物酶的cDNA

本文应用反转录-聚合酶链反应成功的扩增了人谷胱甘肽过氧化物酶的互补脱氧核糖核酸(cDNA)。该法首先从人肝癌细胞中提取信使核糖核酸,在反转录酶的作用下生成cDNA,以此CDNA作为PCR的模板,利用人工合成的两个特异引物,进行35次循环的扩增。电泳结果表明,扩增片段的大小约为600 bp,与文献结果一致,为该酶基因的表达及生产奠定了基础。     

饰胶蛋白(Decorin)基因的cDNA克隆与表达

目的　通过基因克隆技术获得饰胶蛋白基因cDNA克隆并表达。为研究饰胶蛋白的生物学功能及应用打基础。方法　应用PCR技术从T细胞cDNA文库获得饰胶蛋白全长基因cDNA片段 ,并克隆到pUC1 9载体中 ,采用Sanger双脱氧末端终止法测定全部cDNA序列 ,将测序正确的饰胶蛋白cDNA序列插入pGEX 4T 1表达载体中 ,经BamHI和EcoRI双酶切后 1 2 %凝胶电泳鉴定 ,IPTG诱导表达产物经SDS PAGE分析。结果　克隆的饰胶蛋白cDNA序列与GenBank中AF1 3830 0记载的序列完全一致 ,所表达的融合蛋白质分子量与理论计算值(65 6KD)也一致并为可溶性蛋白。结论　本研究成功地克隆了饰胶蛋白基因和表达了GST Decorin融合蛋白     

人TSHR膜外区cDNA克隆及真核表达载体的构建

目的通过生物技术获得促甲状腺激素受体膜外区表达载体,为TSHR膜外区的研究提供有力工具。方法从人甲状腺组织中提取总RNA,RT-PCR分离得到TSHR膜外区cDNA,双酶切后插入真核表达载体pcDNA3.1(+)。结果经酶切鉴定、测序分析表明TSHR膜外区片段与GenBank提供的完全相同。结论成功构建了人TSHR膜外区真核表达载体。     

应用抑制性消减杂交技术筛选HBxAg蛋白结合蛋白XBP1的上调基因

目的应用酵母双杂交及生物信息学(bioinformatics)技术获得HBxAg蛋白结合蛋白XBP1,为了解该基因的反式调节机制,利用抑制性消减杂交技术筛选并克隆XBP1蛋白反式激活的靶基因。方法以XBP1表达质粒pcD-NA3.1(-)-myc-his(A)-XBP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)-myc-his(A)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并合成cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组,分别衔接两种不同接头,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次PCR反应,产物与T/A克隆载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR鉴定后进行测序及同源性分析。结果成功构建人XBP1蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA。扩增后得到80个200～1 000bp插入片段的克隆,随机挑选其中30个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得28个已知编码序列基因和2个未知的新基因。结论 XBP1在肝细胞内表达后能够上调HepG2细胞中许多不同基因表达的变化,这些基因与细胞信号转导、细胞增殖与分化、免疫应答、能量代谢、细胞凋亡、肿瘤发生等生物过程密切相关。     

丙型肝炎病毒C区截短型基因原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

目的建立稳定表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的原核表达系统,获得高产量的纯化核心蛋白。方法应用多聚酶链反应(PCR),以HCV-H株全长cDNA序列为模板,扩增获得C区羧基端部分缺失的基因片段,克隆入原核表达载体pBVIL1,构建原核表达载体pBVIL1-Ct,转化HB101宿主菌,通过温度诱导表达截短型C蛋白。结果扩增得到目的基因长度为462bp,构建pBVIL1-Ct表达载体,在HB101宿主菌中通过温度诱导获得稳定表达,表达蛋白占菌体总蛋白含量的24%。Western-Blot及ELISA检测证实表达产物可与HCV患者阳性血清发生特异性结合反应。结论羧基端部分缺失的HCV C区基因片段可在大肠杆菌中稳定表达并具有良好的反应原性。     

DESIGN OF ANTI-CD3 ScFv-B7.1 FUSION MOLECULE AND PREDICTION OF ITS BIOLOGICAL CHARACTERISTICS

Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓｈａｖｅｓｈｏｗｎ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓｉｎｔｕｍｏｒｃｌｉｎｉｃａｌａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎａｎｄｂａｓｉｃｒｅｓｅａｒｃｈ .Ａｎｔｉ ＣＤ3ＳｃＦｖ(ａｎｔｉ ＣＤ3Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｖａｒｉａｂｌｅｒｅ ｇｉｏｎ)ｉｓａｋｉｎｄｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄａｎｔｉｂｏｄｙｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｍｕｒｉｎｅＯＫＴ3ｈｙｂｒｉｄｏｍａ .Ａｓａｐｏｔｅｎｔｍｉ…     

疏水色谱分离人腮腺液蛋白影响因素初探

初步建立了一种分离纯化人腮腺液蛋白的方法。探讨了样品的预处理、不同固定相、流动相以及不同检测波长等因素对正常人腮腺液蛋白疏水色谱分离的影响。结果在４０ｍｉｎ梯度内，以２ｍｏｌ／Ｌ硫酸铵为Ａ流动相，以０．０５ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钾为Ｂ流动相（１００％Ａ∶０％５～０％Ａ∶１００％Ｂ），腮腺液蛋白被分离出６个峰。经生化方法证实，用疏水色谱分离人唾液蛋白的方法，分离度好，保持了蛋白样品的生物活性，且样品处理简单，可成为研究人唾液蛋白成分的一种较理想的方法。     

黑米糠铁相对生物利用率研究

为了评价黑米糠中铁的可利用程度,本文用Hb恢复法研完了黑米糠铁的相对生物利用率(RBA)。将复制成功的贫血大鼠分为甲、乙、丙、丁和戊五组,在低铁基础饲料基础上,甲组加FeSO_4铁;乙组加糠;丙组加糠和Vc,丁组加糠和熟瘦猪肉,戊组不加为阴性对照组。结果:甲、乙、丙、丁组饲料铁转化入Hb的效率依次为59%、33%、33%和39%,RBA依次为100%,56%、56%和66%。     

人B7.2(CD86)胞外区原核表达及其工程菌发酵培养的实验研究

目的　利用原核系统表达人B7.2 (IgV +C)并对工程菌发酵培养条件进行优化。方法　用聚合酶链反应 (PCR)技术从B7.2cDNA全长中克隆B7.2 (IgV +C) ,将PCR产物克隆入表达载体 pGEX 4T 3从而得到重组体 pGEX 4T 3 /hB7.2 (IgV +C) ,SDS PAGE及Westernblot用于检测目的蛋白的表达 ,同时对目的蛋白诱导表达时间及诱导剂浓度进行优化 ,对重组质粒的遗传稳定性进行鉴定。结果　Westernblot结果显示相应分子质量 5 5kD处有hB7.2 (IgV+C)与GST融合蛋白的高效表达 ,表达量占菌体总蛋白的 3 0 %左右。对工程菌进行发酵培养研究的结果表明 ,所构建的重组质粒在工程菌DH5α中传代稳定 ,未见质粒丢失 ,目的蛋白的表达不受影响 ,且在 3 7℃诱导 5h、IPTG终浓度为 4mmol·L- 1 时其表达量最多。结论　证明了利用原核系统表达人B7.2 (IgV +C)的可行性。     

THE EUKARYOTIC EXPRESSION OF HUMAN PERFORIN PROTEIN AND THE ESTABLISHMENT OF HYBRIDOMAS PRODUCING ANTI-HUMAN PERFORIN PROTEIN

Perforin is expressed mainly in activated cyto-toxic T lymphocytes (CTLs ) and natural killer(NK) cells. The human perforin gene has beencloned. The full length of its cDNA is l668bp, andthe mature HP protein is made up of 534 aminoacid residues with a molecular weight of 66Kd~75Kd. In CTLs and NK cells, perforin is stored incytoplasmic granules and is a major effector of cy-tolysis by these cells. Upon granules releasing,perforin monomers insert into the plasma mem-branes of target ce…     

川芎嗪对脑血管内皮细胞ICAM-1表达的影响

用细胞培养技术，观察了中药川芎嗪对培养脑微血管内皮细胞间粘附分子（IntercellularAdhesionMolecule－1，ICAM－1）表达的影响。细胞因子肿瘤坏死因子（TNF－α）和脂多糖（LPS）作用24h，使内皮细胞ICAM－1表达上调，预先用中药川芎嗪注射液处理3Omin，再用相同的细胞因子刺激，ICAM-1表达不升高。提示川芎嗪可抑制TNF－α和LPS引起的ICAM－1表达增加。     

血液系统恶性肿瘤细胞共刺激分子的检测及其临床意义

目的　探讨共刺激分子B7 1(CD80 )在血液系统恶性肿瘤发病学及免疫基因治疗中的重要作用。方法　应用免疫荧光法检测了 76例恶性血液病患者共刺激分子B7 1及MHCⅠ、MHCⅡDR分子的表达 ,并与自体瘤苗主动免疫治疗的疗效进行了相关分析。结果　所有患者MHCⅠ类分子表达均阳性 (10 0 % ) ,MHCⅡDR分子表达阳性率为95 %。B7 1在急性单核细胞白血病 (M5 )及多发性骨髓瘤 (MM)表达阳性率较高 ,分别为 6 9%和 10 0 % ,而在粒细胞起源的白血病几乎无表达。这与自体瘤苗免疫治疗的临床疗效基本符合 ,即疗效好的M5和MM病例 ,其B7 1表达均阳性 ,而B7 1阴性者几乎无疗效。结论　缺乏共刺激分子 (如B7 1)是血液肿瘤细胞逃避宿主免疫监视的重要原因 ,可能是人类血液肿瘤的发病机理之一 ;B7 1介导的免疫基因治疗将成为治疗人类血液系统恶性肿瘤尤其是急性白血病的一种有效方法 ,具有重要的临床应用价值     

人UCA1基因新剪接变异体全长cDNA序列的克隆

目的克隆新的UCA1剪接变异体全长cDNA序列,为研究其可变剪接机制奠定基础。方法用电子克隆技术和cDNA序列末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)扩增细胞系BLZ-211cDNA并进行产物测序和序列拼接。结果新克隆的UCA1剪接变异体全长cDNA序列为2 202bp。结论综合采用电子克隆技术与RACE技术是获得全长cDNA序列的有效方法,为该基因的后续可变剪接机制的研究奠定了基础。