西安地区肠杆菌科细菌的超广谱β-内酰胺酶基因型的研究

目的测定西安地区肠杆菌科细菌中的超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBL)的基因型。方法在西安市的5所医院中随机选取产ESBL的肠杆菌科细菌25株(共125株),采用PCR方法特异性扩增TEM、SHV和CTX-M型酶的基因片段。结果在125株产ESBL菌中,有33株扩增出TEM型酶基因片段;有27株扩增出特异性SHV型酶基因片段;有49株扩增出特异性的CTX-M型酶基因片段;共有22株细菌同时扩增出两种以上的酶基因片段。结论在西安地区的ESBL肠杆菌科细菌中CTX-M型酶较为流行。     

肺炎克雷伯菌产超广谱β-内酰胺酶的基因分型

目的研究西安交通大学医学院第一附属医院临床分离的肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的基因型分布特点。方法收集从临床住院患者中分离的肺炎克雷伯菌83株,ESBLs表型确认试验采用双纸片协同法,ESBLs耐药基因CTX-M、TEM和SHV的检测采用PCR法。结果 83株肺炎克雷伯菌中表型确证实验有76株ESBLs阳性,占91.6%;PCR法检测到携带有耐药基因的菌株41株,CTX-M、SHV和TEM 3种耐药基因的构成比分别为78.1%(32/41)、43.9%(18/41)和34.2%(14/41);在41株产酶菌株中,携带1种基因型的占39.0%(16/41),携带2种基因型的占34.2%(14/41),携带3种基因型的占14.6%(6/41),携带4种基因型的占9.8%(4/41),携带5种基因型的占2.4%(1/41)。结论该院肺炎克雷伯菌ESBLs的基因型主要以CTX-M型和SHV型为主,其基因型分布复杂。     

鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药分子特征的研究

目的对110株鲍曼不动杆菌临床分离株进行菌种鉴定,检测其对碳青霉烯类抗生素的耐药性,并在DNA水平对碳青霉烯酶进行分子鉴定。方法收集110株经VITEK-2鉴定的鲍曼不动杆菌,利用特异性引物sp2F、sp4F和sp4R通过PCR扩增法复检菌株;使用VITEK-2检测鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南的药物敏感性;PCR法检测碳青霉烯酶基因,分析耐药基因型,并使用χ2检验分析碳青霉烯酶与耐药表型的相关性。结果 110株临床样本中96株确认为鲍曼不动杆菌,对亚胺培南和美罗培南的耐药率达83.3%。blaTEM、blaOXA-23-like和blaOXA-51-like等3个碳青霉烯酶基因检测阳性,检出率在所有鲍曼不动杆菌中分别为77.1%、83.3%及100%,并以多基因联合耐药模式为主。blaOXA-23-like与耐药表型显著相关,其次为blaTEM。结论特异性PCR法鉴定鲍曼不动杆菌快速、准确。鲍曼不动杆菌临床分离株对碳青霉烯类抗生素耐药性高,主要由碳青霉烯酶blaOXA-23-like和blaTEM引起。     

rep-PCR法在检测产超广谱β内酰胺酶大肠艾希氏菌院内流行中的应用

目的分析重复序列引物聚合酶链反应(rep-PCR)的优化条件,并采用本方法分析本院呼吸科病房不同患者痰标本中分离到的产超广谱β内酰胺酶(ESBL)大肠杆菌是否起源于同一菌株。方法用双纸片确定法测定是否产ESBL;用K-B法测定对抗生素的敏感程度;选用肠道菌广泛存在的基因间重复片断为引物进行扩增,并对实验条件进行优化;对产ESBL大肠艾希氏菌进行基因分型分析。结果建立了rep-PCR法方法,显示可将大肠艾希氏菌扩增出丰富的区带。分离到的22株产ESBL大肠艾希氏菌分属3个基因型。结论rep-PCR法可用于医院院内感染的流行病学调查。     

Carba NP试验检测碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的临床应用

目的探讨Carba NP试验检测碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的临床应用。方法收集碳青霉烯类抗生素耐药的51株肠杆菌科细菌,K-B法药敏试验检测常规药物敏感性,E-test法检测试验菌株对碳青霉烯类抗生素的最低抑菌浓度(MIC)值;分别用改良Hodge、Carba NPⅠ试验筛选碳青霉烯酶表型;然后用Carba NPⅡ试验进行碳青霉烯酶表型分类,E-test法测定金属酶,用PCR检测耐药基因。结果 41株Carba NPⅠ试验阳性且经Carba NPⅡ试验证实为产B类金属酶菌株,PCR均证实携带NDM-1基因型。结论 Carba NP试验方便快捷、结果易于判断,与耐药基因检测符合程度高,适合实验室常规开展。     

西京医院呼吸ICU 2008～2011年感染病原菌的调查及耐药性变迁

目的通过对呼吸重症监护病房(RICU)临床分离的非重复性感染病原菌的分离率及对抗菌药敏感率进行调查,明确病原菌的流行和耐药状况,为控制多重耐药菌株暴发流行及经验性应用抗菌药物提供依据。方法收集第四军医大学西京医院RICU 2008～2011年临床分离的非重复性感染病原菌,按美国临床实验室标准化协会(Clinicaland Laboratory Standards Institute,CLSI)标准进行药敏试验及超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamas-es,ESBLs)表型检测,分析细菌种类及耐药率变迁。结果 2008～2011年RICU共分离非重复性病原菌1 072株,每年分离的前3位病原菌均为鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌;肠杆菌科细菌对β-内酰胺类及喹诺酮类抗菌药耐药率较高,对氨基糖苷类及碳青霉烯类抗菌药耐药率低;非发酵菌对β-内酰胺类抗菌药耐药率有所上升,鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药耐药率上升,铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗菌药耐药率无明显变化;大肠杆菌连续4年ESBLs检出率为100%,肺炎克雷伯菌ESBLs检出率最高达95.5%,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)检出率较高(>89.6%)。结论连续4年RICU感染病原菌以革兰阴性杆菌为主,ESBLs和MRSA检出率较高,给临床抗感染治疗带来巨大的挑战。     

耐亚胺培南鲍曼不动杆菌的耐药性分析及金属β-内酰胺酶的检测

目的 了解我院鲍曼不动杆菌的耐药性及其产金属β-内酰胺酶(MBLs)的情况.方法 采用K-B纸片扩散法测定13种抗菌药物的耐药性;分别用金属螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)和2-巯基丙酸抑制试验测定鲍曼不动杆菌产金属β-内酰胺酶的情况.结果 91株鲍曼不动杆菌中有23株对亚胺培南耐药,其仅对阿米卡星和米诺环素耐药率较低,分别为21.7%和26.1%;对头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦和环丙沙星部分耐药,耐药率分别为52.2%、43.5%和65.2%;对头孢吡肟耐药率非常高(91.3%);对氨苄西林/舒巴坦、庆大霉素、头孢噻肟、头孢他啶、复方磺胺和美罗培南全部耐药;与亚胺培南敏感组比较,除阿米卡星、环丙沙星、米诺环素外,亚胺培南耐药组对其他抗生素的敏感率明显降低、耐药率明显增高(P<0.05).23株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌金属β-内酰胺酶的检出率为65.2%(15/23).结论 耐亚胺培南不动杆菌的耐药现象非常严重,临床应根据药敏结果合理选用抗生素; 金属β-内酰胺酶的产生是鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的重要机制之一,实验室应加强对产酶菌株的监测.     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因多态性分型研究

目的 探索一种准确、快速、可靠的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的分子生物学分型方法,了解医院内MRSA的多态性,为临床合理、有效地使用抗生素和控制耐药基因在种群间的传播提供帮助.方法 用MecA基因相关高变区PCR扩增(HVR-PCR)和随机扩增多态性DNA(RAPD)两种方法,对MRSA菌株进行多态性分析.HVR-PCR检测MecA基因相关高变区正相重复序列元件(DRUs)的长度,根据DRUs数目的 不同对MRSA分型;RAPD根据电泳图谱中条带的数目及位置,经NTSYS统计软件进行聚类分析,得到遗传树状图,按MRSA菌株之间的相关性进行分型.结果 应用HVR-PCR方法可将31株MRSA标本分为7型,分别含有7、8、9、10、11、12和16个DRUs,其中10DRUs型最多[11/31(35.48%)],16DRUs型最少[1/31(3.23%)];应用RAPD分型,31株MRSA共分10型,其中以Ⅳ型为主[10/31(32.26%)],其他型分布比较接近.在11株HVR-PCR分型的10DRUs型中RAPD Ⅳ型4株[4/11(36.36%)],RAPD Ⅲ型和RAPD Ⅳ型各2株[2/11(18.18%)];10株RAPD Ⅳ型中9DRUs型、10DRUs型各4株[4/10(40.00%)].结论 RAPD方法和HVR-PCR方法对MRSA的分型率都比较高,而且这两种方法都比较简单、稳定、可靠、快速,实用性强,具有广阔的应用前景.     

秦巴山区人巨细胞病毒gN基因型分布及其与宫内感染的关系

目的 探讨陕西秦巴山区母婴人巨细胞病毒(HCMV)感染流行株的包膜糖蛋白gN基因型分布及其与HCMV宫内感染结局的相关性.方法 采用ELISA法检测434例孕期妇女血清中HCMV-IgM及HCMV-IgG,判断秦巴山区孕期妇女HCMV感染情况;采用PCR方法检测孕妇血清和新生儿尿液中的HCMV gN基因,利用限制性核酸内切酶SacⅠ、SalⅠ和ScaⅠ分别对 HCMV gN基因进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析.结果 ①434例孕妇血清中HCMV-IgM阳性35例,阳性率8.06%;HCMV gN DNA阳性25例,阳性率为5.76%.新生儿尿液中HCMV gN DNA阳性17例,阳性率为3.92%.在35例HCMV-IgM阳性孕妇中,其配对新生儿尿液HCMV gN DNA阳性11例,HCMV宫内传播率为31.43%.②42例HCMV gN DNA阳性标本(25例孕妇及17例新生儿)gN3型2例、gN4型40例,8例症状性 HCMV感染婴儿与8例无症状性感染婴儿及其母亲均具有相同的基因型gN4型;1例病理性黄疸患儿与其母亲基因型为gN3.③新生儿感染症状及预后与基因型之间无相关性. 结论陕西秦巴山区母婴 HCMV流行株以gN4型为主.gN3、gN4基因型可引起母婴传播.     

脂联素基因启动子区多态性与肥胖、2型糖尿病的相关性

目的探讨中国人群内脂联素基因启动子区-11391G/A、-11377C/G基因多态性以及突变与肥胖、2型糖尿病(T2DM)的相关性。方法选取研究对象共305名,利用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)方法鉴定-11391G/A、-11377C/G基因型。结果①在所选群体中未发现-11391G/A突变;②以基因型分组:-11377 GG基因型体重指数(BMI)值明显高于CC,CG基因型,且具有统计学意义(P<0.05);GG基因型舒张压、收缩压明显高于CC,CG基因型,且与CG基因型差别有统计学意义(P<0.05);CC基因型高密度脂蛋白(HDL)最高且与CG基因型差别有统计学意义(P<0.05)。结论在西安人群内未发现-11391G/A突变;-11377C/G基因多态性与BMI的相关性具有统计学意义;未发现11377C/G基因多态性与2型糖尿病的相关性。     

β2肾上腺素能受体基因多态性与维吾尔族肥胖的关系

目的探讨β2肾上腺素能受体(β2-adrenergic receptor,β2-AR or ADRB2)基因R16G、Q27E多态性与新疆维吾尔族人群肥胖发生的相关性。方法采用Taqman技术对新疆754例维吾尔族受试者进行β2-AR基因R16G、Q27E位点基因分型,并分析各基因型和等位基因频率在不同体重指数(BMI)水平的分布及其与超重、肥胖的关系。结果维吾尔族人群中超重组与肥胖组的血压、甘油三酯及胆固醇水平显著高于正常体重组(P<0.05)。R16G、Q27E两个多态位点的基因型频率与等位基因频率在正常体重组、超重组与肥胖组之间的分布均无统计学差异(P>0.05);按性别分层后基因型与等位基因频率的分布在3组间亦未见统计学差异。R16G、Q27E多态构成的4种单倍型在正常体重组、超重组与肥胖组的分布无统计学差异(P>0.05)。维吾尔族与汉族人群间比较,Q27E基因型与等位基因频率分布的差异有统计学意义(P<0.001)。结论β2-AR基因R16G、Q27E多态性与新疆维吾尔族人群肥胖发生无关,但Q27E基因型与等位基因频率分布在汉族与维吾尔族人群间不同。     

非多重耐药及多重耐药鲍曼不动杆菌外排泵及其表达

目的探讨多重耐药鲍曼不动杆菌(multidrug resistant Acinetobacter baumannii,MDRAB)及非多重耐药鲍曼不动杆菌(non-multidrug resistant Acinetobacter baumannii,N-MDRAB)的外排泵表型、基因型和外排泵基因表达情况。方法应用K-B法将120株临床分离的鲍曼不动杆菌,分成MDRAB 96株和N-MDRAB 24株两组;参照Sylvia Valdezate方法检测鲍曼不动杆菌的外排泵表型,即采用微量肉汤稀释法,观察加入泵抑制剂羰基氰氯苯腙(CCCP)前后其MIC值的变化,筛选出加入泵抑制剂后MIC值比原值降低1/4倍或以上的菌株为AB外排泵表型阳性;PCR法扩增外排泵蛋白基因并测序进行序列分析。结果 96株MDRAB对β-内酰胺类、头孢菌素类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类、磺胺类、多黏菌素类抗菌药物的耐药率分别为76.04%~92.71%、73.96%~97.92%、40.63%~42.71%、92.71%~98.96%、93.75%~98.96%、98.96%、79.17%、0。24株N-MDRAB对头孢菌素类、β-内酰胺类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类、磺胺类、多黏菌素类抗菌药物的耐药率分别为16.52%~20.43%、11.22%~15.65%、0、17.83%~18.26%、20.43%~23.39%、14.78%、19.57%、0。外排泵抑制检测结果显示,96株MDRAB有34株外排泵阳性,外排泵基因检测有33株adeB、32株adeR、33株adeS、33株adeJ、0株adeE和33株abeM,检出阳性率分别为97.06%、94.12%、97.06%、97.06%、0、97.06%;24株N-MDRAB未检测到外排泵阳性菌株,但外排泵基因检测有12株adeB、20株adeR、16株adeS、18株adeJ、0株adeE和16株abeM,检出阳性率分别为50%、83.33%、66.67%、75%、0、66.67%。对adeB、adeR、adeS、adeJ、abeM基因进行测序,经比对,所测序列与GenBank中序列同源性为100%。结论外排泵基因广泛存在于MDRAB中,但在N-MDRAB中亦可以发现主动外排泵基因的存在。     

西安地区2009年鼠类携带汉坦病毒的基因特征研究

目的研究西安地区2009年捕获鼠类种类和携带汉坦病毒情况,分析汉坦病毒的基因特征。方法在西安地区近年来肾综合征出血热高发的户县、长安两区县以夹夜法捕鼠,记录鼠种和生存环境。无菌解剖后取鼠肺提取总RNA,扩增汉坦病毒M片段基因进行病毒分型,选取部分阳性标本进行病毒S片段和L片段序列测定和进化分析。结果 2009年两区县捕获鼠类共400只,其中黑线姬鼠244只,占61%,褐家鼠89只,占22.25%,小家鼠43只,占10.75%,其他鼠种24只,占6%;共检出汉坦病毒核酸阳性鼠肺86只,分型以汉滩型为主,占79.07%;病毒L片段与贵州代表株同源性为95%~97%,S片段与贵州代表株同源性为97.7%~99.3%。结论 2009年西安地区汉坦病毒宿主以黑线姬鼠、褐家鼠、小家鼠为主,汉坦病毒核酸阳性率较高;所携带病毒以汉滩型为主,病毒进化分析与贵州代表株高度同源。     

GSTM1基因多态性及启动子甲基化在结肠癌细胞系中的研究

目的研究参与内毒物代谢的重要酶谷胱甘肽-S-转移酶M1(glutathione-s-transferase M1,GSTM1)在结肠癌细胞系中的基因表达状况与其遗传基因型及启动子甲基化的关系。方法采用多重PCR方法检测GSTM1基因型,甲基化特异PCR(MSP)方法检测GSTM1基因启动子甲基化状态;用5-aza-dC处理结肠癌细胞系,RT-PCR方法检测GSTM1基因转录水平。结果结肠癌细胞系HT29、SW480、SW1116为GSTM1非空白基因型,而HCT116、Lovo、Colo结肠癌细胞系为GSTM1空白基因型。MSP检测发现SW1116细胞中GSTM1基因主要呈非甲基化状态,其他5个细胞系中呈甲基化状态,而且基因表达缺失。经5-aza-dC处理后,HT29和SW480细胞的GSTM1基因表达复活,而HCT116、Lovo、Colo细胞中GSTM1仍无扩增。结论 GSTM1基因转录受到遗传基因型和表观遗传启动子甲基化双重调控。     

生长分化因子5单核苷酸多态性与大骨节病的相关性

目的 探讨生长分化因子5(GDF5)基因3个单核苷酸多态性(SNP)位点多态性与大骨节病的关系.方法 用限制性核酸内切酶酶切方法对103例大骨节病患者和91例健康人的GDF5基因上的3个SNP位点进行基因分型,计算相应人群中3个位点的基因型频率,比较各组间基因型频率的差异.结果 单倍型重构分析显示单倍型AT、TGC和 TAT在大骨节病患者和健康人群之间存在差异,但3个位点单位点关联分析未显示与大骨节病具有相关性.结论 单倍型TGC与大骨节病具有相关性.     

IL-1β-511位点和TNF-α-308位点基因多态性与陕西汉族非贲门胃癌的关系

目的 探讨促炎症因子白细胞介素(IL)-1β基因启动子区-511位点及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)-308位点基因多态性与陕西汉族非贲门胃癌易感性的关系.方法 用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的方法对陕西汉族106例非贲门胃癌及108例非溃疡性消化不良患者(对照组)进行IL-1β启动子的-511位点和TNF-α的-308 位点多态性分析.结果 IL-1β基因启动子-511位点基因型CC、CT、TT频率在胃癌组和对照组分别为12.3%、54.7%、33%和16.7%、50.9%、32.4%,无显著性差异(P＞0.05).等位基因C、T频率在胃癌组和对照组分别为39.6%、60.4%和42.1%、57.9%,其基因型频率和等位基因频率在胃癌组和对照组比较均无显著性差异(P＞0.05).TNF-α的-308位点的基因型GG、GA、AA频率在胃癌组和对照组分别为90.6%、1.9%、7.5%和84.3%、12.9%、2.8%,等位基因G、A频率在胃癌组和对照组分别为91.5%、8.5%和85.6%、14.4%,其基因型频率和等位基因频率在胃癌组和对照组比较均无显著性差异(P＞0.05).结论 IL-1β启动子-511位点基因多态性及TNF-α-308基因多态性与陕西汉族非贲门胃癌之间未发现相关关系.     

CD40基因多态性与自身免疫性甲状腺病的相关性

目的了解CD40基因多态性在西北地区汉族人群中的分布及其与自身免疫性甲状腺病(AITD)的相关性。方法随机选取本院内分泌科门诊的165例Graves病(GD)患者、113例桥本甲状腺炎(HT)患者为研究对象,以94例健康体查者为对照。①应用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性技术检测CD40基因5′非翻译区-1位点C/T多态性(5′UTR C(-1)T)、第三外显子58038位点-/T多态性;②应用扩增受阻突变系统-聚合酶链反应检测第九外显子64610位点C/G多态性。结果①5′UTR C(-1)T位点中CC基因型、C等位基因在GD组和对照组间有显著差异(P<0.05);②58038位点在372例样本中均为TT型;③64610位点未发现GG基因型。结论①西北地区汉族人CD40基因5′UTR C(-1)T位点上C等位基因型与GD发病有相关性,CC基因型者患GD的危险性较TT高;②58038位点-/T在西北地区汉族人中无多态性;③64610位点C/G在西北地区汉族人中未发现GG基因型。     

E-cadherin基因启动子C-160A SNP与胃癌的相关性

目的探讨E-cadherin基因启动子区C-160A与胃癌易感性之间的联系。方法通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,分析150例健康人群(对照组)和150例胃癌患者(胃癌组)的E-cadherin启动子区-160位点SNP情况。结果胃癌组E-cadherin基因启动子区-160位点基因型和等位基因型分布与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。根据吸烟状况、上消化道恶性肿瘤家族史和术后病理分期分层分析发现,无论吸烟与否,在胃癌患者和健康个体中,E-cadherin-160基因型及等位基因型分布均有显著性差异(P<0.05),而无论吸烟状况、上消化道恶性肿瘤家族史和病理分期状态,E-cadherin-160基因型及等位基因型在胃癌患者中的分布未呈现出显著性差异(P>0.05)。结论 E-cadherin C-160A多态性基因型和等位基因型与胃癌的易感性相关,E-cadherinC-160A多态性与胃癌患者吸烟状况、上消化道肿瘤家族史和术后病理分期之间无相关性。     

雌激素受体基因多态性与陕西关中地区绝经后妇女骨密度的相关性

目的探讨雌激素受体(ER)基因多态性在陕西关中地区汉族绝经后妇女中的分布及其与骨密度的相关性。方法通过对1 200例陕西关中地区汉族绝经1-4年、年龄48-56(平均53)岁的妇女测定其不同部位的骨密度(BMD)值,并对每个样本测其血钙、血磷、甲状旁腺激素(PTH)及尿Ⅰ型胶原交联N末端肽(NTX)水平,同时检测雌激素受体基因PvuⅡ、XbaⅠ位点的多态性,方差法分析ER基因多态性与骨密度的相关性。结果雌激素受体基因PvuⅡ酶切多态性位点的三种基因型间在股骨颈和Ward三角的BMD存在着显著性差异(P<0.001)。雌激素受体基因XbaⅠ酶切多态性与各检测指标无显著性差异(P>0.05)。结论雌激素受体基因PvuⅡ多态性可能对陕西关中地区绝经后妇女股骨颈和Ward三角BMD有一定的影响,雌激素受体基因XbaⅠ基因型与骨密度间无明显相关性。     

丙型肝炎病毒1b DY株ns5a基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆和表达丙型肝炎病毒（HCV）1b型地方株DY株ns5a基因。方法运用原核细胞基因工程技术。设计目的基因的特异引物，采用巢式PCR法，从含HCV1bDY株全长eDNA的质粒HCV17中扩增出约480bp的目的片段，将其插入克隆载体pMD18-Tvector中，再亚克隆到原核表达载体pET-28a中；经酶切、PCR及测序鉴定后转化入BL21菌株，在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达；采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测NS5A蛋白的表达水平。结果成功构建了含有HCV1b DY株ns5a基因的重组体，并得以表达。结论成功构建和表达了HCV1b DY株ns5a基因，为进一步研究HCVns5a的基因型及探讨该基因编码的Ns5A蛋白的性质和生物学活性创造了条件。