NLCM纯化的不同分化程度贲门腺癌细胞差异蛋白质组学研究

目的联合导向激光捕获显微切割技术(NLCM)及蛋白质组学技术比较分析高分化贲门腺癌细胞和低分化贲门腺癌细胞的蛋白质表达图谱差异,寻找与贲门腺癌恶性程度和预后有关的分子标志物。方法应用导向激光捕获显微切割技术分别获取高分化和低分化贲门腺癌细胞,提取蛋白质,应用双向凝胶电泳(2-DE)技术分离蛋白质,选定差异点,胶内酶解后,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)鉴定差异蛋白质,并用免疫组化方法验证差异蛋白的表达。结果 1NLCM分别分离纯化了高分化和低分化贲门腺癌细胞;2建立了高分化和低分化贲门腺癌细胞的蛋白质表达图谱,两组分别检测到(846±52)个和(923±84)个蛋白质点,两组的匹配率为85.4%;3对高分化和低分化的贲门腺癌蛋白质表达谱进行比较分析,鉴定出10种差异蛋白,其中6个蛋白质在低分化贲门腺癌细胞中表达上调,4个蛋白质在低分化贲门腺癌细胞中表达下调;4差异蛋白质涉及细胞间信号转导、细胞代谢、凋亡及迁移等;5进一步通过免疫组化方法验证了差异蛋白HSP27的表达与蛋白质组学研究结果一致。结论高分化和低分化贲门腺癌间存在蛋白质表达的差异,这些差异表达的蛋白质可能与贲门腺癌的恶性程度和预后有关。     

人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞7702的差异蛋白质组学研究

目的应用蛋白质组学技术探讨人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞7702的蛋白质差异表达谱,筛选肝细胞癌的特异性标志物。方法应用双向电泳(2-DE)方法对细胞总蛋白进行分离和分析,用质谱(MS)鉴定差异表达蛋白,并用免疫组化方法验证部分差异表达蛋白。结果与7702细胞相比,在HepG2细胞中鉴定出17种差异表达蛋白,10种上调,7种下调,主要涉及物质代谢酶和抗凋亡、调节应激和细胞间信号传导的蛋白质;免疫组化结果验证了膜联蛋白A1(annexin A1)和亲环蛋白A(cyclophilin A)在肝细胞癌病理组织中均明显上调,且主要定位于胞质内。结论人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞7702的蛋白质表达差异显著,其中膜联蛋白A1和亲环蛋白A可作为肝细胞癌诊断及治疗的分子标志物。     

基于鸟枪法蛋白质组学和生物信息学技术对肺鳞癌表达蛋白质谱的分析

目的应用高通量蛋白质组学及生物信息学技术分析肺鳞癌表达蛋白质谱,筛选肺癌标志蛋白质,为肺鳞癌发病机制、早期诊断及治疗提供有价值的线索。方法 6例手术后新鲜肺鳞癌组织,通过激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)分离纯化肿瘤细胞并提取可溶性总蛋白;多维液相色谱-离子阱串联质谱技术(也称鸟枪法蛋白质组学,shot gun proteomics)对蛋白质进行分离、鉴定;进一步通过生物信息学工具预测肺鳞癌细胞表达蛋白质的理化性质、分子功能、生物通路及蛋白质相互作用,并筛选潜在的标志蛋白。结果 LCM共收集了60个帽(cap)的感兴趣细胞,平均每个LCM cap捕获感兴趣细胞数约12000个,其同质性大于95%。可溶性总蛋白经多维液相色谱-离子阱串联质谱共鉴定出860个非冗余蛋白质。蛋白质的理化性质包括分子量、等电点、平均疏水性、跨膜结构域、亚细胞定位、转录后修饰和组织分布等经过在线生物信息学工具分析,并通过统计图直观显示;蛋白质生物学功能基于Gene Ontologyc(GO)软件和Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)生物学通路分析,根据其注解,筛选出3个有价值的蛋白质,即分裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、粘联素A1(annexin A1,ANXA1)、高移动组蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGPB1)可以作为肺鳞癌候选的标志蛋白。结论鸟枪法蛋白质组学可大规模分离、鉴定肿瘤细胞表达蛋白质,基于生物信息学筛选的标志蛋白质可能成为肺癌诊断和治疗的分子靶点。     

多重耐药鲍曼不动杆菌的临床流行特征

目的对西安交通大学第一附属医院收集的多重耐药鲍曼不动杆菌进行菌种确认,并检测其临床感染分布特点、耐药性及分子分型特征。方法收集经VITEK-2鉴定的多重耐药鲍曼不动杆菌47株,利用特异性引物sp2F、sp4F和sp4R通过PCR扩增的方法复检菌株;使用VITEK-2检测鲍曼不动杆菌的药物敏感性;通过多位点序列分型(MLST)方法分析临床菌株的同源性。结果经过特异性PCR扩增法确认,47株临床样本中有46株为鲍曼不动杆菌,它们大多分离自痰标本,主要收集于重症监护室,呈多重耐药性。MLST分析发现ST195、ST218、ST368及ST208共4种ST型,其中ST368与ST208亲缘关系最近。结论特异性PCR扩增法可快速、准确地鉴定鲍曼不动杆菌。本院的多重耐药鲍曼不动杆菌主要分布在重症监护室,仅对替加环素等少数抗生素有较高敏感性,存在同源性差异。     

肿瘤间质灌注液蛋白质组学研究

目的 探讨肿瘤间质灌注液蛋白质组作为分析肿瘤组织中细胞微环境蛋白质组的可能性.方法 应用PBS液孵育新鲜肿瘤组织,提取肿瘤间质灌注液中的总蛋白,并应用蛋白质组学技术对其进行分析研究.结果 应用双向电泳、质谱和生物信息技术成功分离并鉴定出肿瘤间质灌注液中的蛋白成分;在肿瘤间质灌注液中发现肿瘤分泌蛋白Profilin-1.结论 肿瘤间质灌注液蛋白质组学研究为研究肿瘤组织中细胞微环境蛋白质组提供了新的研究方案.     

临床致病性不动杆菌的分子生物学鉴定

目的对临床致病性不动杆菌进行种属鉴定,并比较3种方法(44℃生长试验、特异性引物PCR扩增和16SrRNA测序)对鲍曼不动杆菌鉴定的特异性、准确性及应用价值。方法收集临床致病不动杆菌56株,首先接种在胰蛋白胨大豆肉汤中44℃进行培养,观察是否可以生长;其次,提取56株不动杆菌基因组DNA,用两组不同的特异性引物进行PCR扩增鉴定;最后,用通用引物对56株不动杆菌的16SrRNA进行测序鉴定。结果 56株不动杆菌中有17株可在44℃生长。经特异性引物PCR扩增鉴定,发现8株鲍曼不动杆菌和3株13TU型不动杆菌均可在44℃中较早较快生长。金标准16SrRNA测序确定56株不动杆菌中含有9个种,其中鲍曼不动杆菌和13TU型不动杆菌的鉴定结果与特异性引物PCR扩增法相同。结论应用分子生物学方法鉴定鲍曼不动杆菌具有准确、高效且可重复性高的优点,尤其是特异性PCR扩增法,可作为较难诊断的鲍曼不动杆菌的首选鉴定方法。     

胎儿生长受限子代大鼠与正常大鼠海马蛋白质组双向电泳图谱比较

目的 比较胎儿生长受限(FGR)子代大鼠与正常大鼠海马蛋白质组双向电泳图谱的差异,探索蛋白质组学技术在FGR引起子代神经系统发育异常的研究中应用的可能性.方法 建立SD大鼠的FGR模型,分离子代大鼠海马组织并提取总蛋白;进行双向电泳,比较FGR子代大鼠与正常大鼠海马组织的蛋白质表达差异.结果 FGR子代大鼠与正常大鼠海马组织双向电泳图谱分别检出647和626个蛋白点,对2张电泳图进行匹配后发现有18个蛋白点仅在FGR子代大鼠海马蛋白双向电泳图谱中表达,28个蛋白在2组大鼠海马组织中含量发生了3倍以上的变化,其中FGR组上调25个,下调3个.结论 初步建立了FGR动物模型比较蛋白质组学的技术方法;FGR子代大鼠海马蛋白质组与正常大鼠存在明显差异,差异点的发现为深入研究FGR引起子代高级神经活动异常的发病机制提供了有益的线索.     

蛋白组学分析放射抗拒性鼻咽癌细胞差异表达蛋白

目的筛选同一来源放射敏感性不同的鼻咽癌细胞蛋白组学差异表达,探讨鼻咽癌放射抗拒机制。方法建立放射敏感性不同的人鼻咽癌细胞株,采用双向凝胶电泳技术和图像分析软件PDQuest分离和分析不同阶段细胞间的差异蛋白质点,采用LC-MS/MS质谱分析系统鉴定差异蛋白质点,采用Gene Oncology Annotation将已知差异蛋白质进行分类。部分筛选蛋白质采用Western blot进行验证。结果 CNE-2和CNE-2R细胞有差异候选差异蛋白质27个,其中11个蛋白质在放射抗拒CNE-2R细胞中表达下调,16个上调。其中的4个:4-3-3σ、GADD45、PRKDC和HSP27用Western blot的方法得到了进一步确认。结论 CNE-2细胞受射线反复照射产生放射抗拒性细胞,在蛋白组学水平上发生了某些突变,并将这些突变稳定的遗传下来,从而表现出放射抗拒性的表型;通过调控其中与放射抗拒性产生相关的某些蛋白表达,就有可能调控细胞的放射敏感。4-3-3σ、GADD45、PRKDC和HSP27是预测NPC放疗敏感性的潜在基因标志物,它们表达失调可能参与NPC放射抗拒性的产生。     

小细胞肺癌及其配对的正常肺组织差异表达蛋白质的双相电泳-飞行时间质谱研究

目的应用比较蛋白质组学方法分析小细胞肺癌(SCLC)与其配对的正常肺组织差异表达蛋白质,为阐明SCLC发病机制、筛选其早期诊断标志物提供有益的思路。方法应用双相电泳(2-DE)分离6例SCLC及其配对的正常肺组织可溶性总蛋白;应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)获得差异蛋白点的肽质量指纹图谱(PMF);通过Mascot软件查询NCBI或SWISS-PROT数据库鉴定蛋白质。结果每张图谱约检测到800多个蛋白质点。经匹配分析,肺癌组织之间和正常肺组织之间凝胶图像的匹配率分别为75.5%和78.2%;选择14个背景清晰、重复性及分辨率较好、蛋白表达差异明显的点进行质谱分析,结合表观分子量及等电点(pI),初步鉴定了11种(六类)蛋白质:①与蛋白质降解通路有关的蛋白质:蛋白酶体α亚单位3型、蛋白酶体β亚单位2型及β亚单位5型;②自由基/抗氧化剂类:锰-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)和黄素还原酶(FR);③细胞骨架类:原肌球蛋白-3(Tpm-3);④与能量代谢有关的蛋白质:硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX1);⑤分子伴侣:抑制素(PHB),内质网蛋白ER29(Erp29);⑥其他:可溶性NSF黏附蛋白(alpha SNAP)。结论应用2-DE及MALDI-TOF-MS方法分离并初步鉴定了11种(六类)蛋白质;这些蛋白质与SCLC发生发展密切相关,部分可能成为SCLC诊断及治疗的分子靶点。     

三羟基异黄酮抑制乳腺癌细胞生长的质谱研究

目的 初步研究低浓度的三羟异黄酮对人乳腺癌细胞系MCF-7的生长抑制作用,并通过蛋白质组学方法探讨其分子机制.方法 MCF-7细胞在含25μmol/L三羟异黄酮的培养液中分别培养1～7d后,进行MTT实验,测得生长曲线;采用顺序抽提的方法将细胞总蛋白分级为水溶性和疏水性两个组分,并应用双向电泳方法对其进行分离,以获取蛋白质的表达谱;通过软件分析,找出表达量存在显著差异的蛋白质点;再应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)与生物信息学相结合的方法对差异表达蛋白点进行分析鉴定.结果 25μmol/L的三羟异黄酮对MCF-7细胞具有明显的抑制作用,并在4d后观察到细胞凋亡现象的出现;双向电泳图谱分析表明无论是水溶性蛋白质还是疏水性蛋白都取得了很好的分离,并成功鉴定出24种差异表达蛋白,其中5种下调,19种上调.结论 这些蛋白质的功能涉及了细胞的生长调节、应激反应、形态和凋亡等多个方面.