重组人突变型471TNF—α及野生型TNF—α表达及活性初步鉴定

目的 采用原核表达系统，表达人突变型471TNF－α蛋白，并检测其生物学活性。方法 采用PCR技术扩增突变型471TNF－α及野生型TNF－α cDNA片段，克隆入中间载体pUCm-T中，并测序证实。以限制性内切酶切下目的片段，克隆入pBV220中，转入大肠杆菌DH5α，温度诱导表达野生型及突变型471TNF－α蛋白。初步纯化蛋白后，采用MTT法评估两者对L929细胞的杀伤作用。结果 ①获得了测序正确的野生型TNF－α及突变型471TNF－α的cDNA克隆；②构建了正常人野生型TNF－α及突变型471TNF－α重组表达质粒；③经温度诱导，TNF－α及突变型471TNF－α蛋白均获得了表达；④初步的生物学活性研究表明，突变型471TNF-α蛋白的杀伤作用显著高于野生型。结论 突变型471-α的生物学活性优于野生型TNF－α，为进一步开展TNF－α的基础及临床研究奠定了基础。     

炎性疼痛对小鼠外周组织炎症反应及TNF-α和MCP-1表达的影响

目的通过甲醛制备小鼠炎性疼痛模型研究炎性疼痛对机体局部组织形态结构、炎症反应以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等炎症因子表达水平的影响。方法 64只健康雄性小鼠随机分为4组,分别给予右前肢腕部注射生理盐水40μL(NS组)、50mL/L甲醛40μL(FCOH组)、5μg/mL利多卡因0.3mL(L组)、5μg/mL利多卡因0.3mL+50mL/L甲醛40μL(FCOH+L组)处理;48h后分离局部组织,HE染色观察炎细胞浸润情况;Western blot检测TNF-α和MCP-1表达水平。结果与NS组相比,FCOH组于处理24h后出现炎症反应高峰,右前肢腕部厚度增加(1.73mmvs.4.02mm,P<0.05),体温升高(37℃vs.38.3℃,P<0.05);FCOH+L组于处理48h后出现炎症反应高峰,右前肢腕部厚度显著增加(1.68mmvs.5.10mm,P<0.05),体温升高(37℃vs.38.5℃,P<0.05)。此外,处理48h后,同FCOH组相比FCOH+L组小鼠右前肢局部组织中炎性细胞浸润程度增高,而TNF-α和MCP-1表达水平降低(P<0.05)。结论炎性疼痛参与调控局部炎症反应的进程,在修复损伤组织中发挥重要作用。炎症反应发生起始阶段阻断疼痛传递可以增加中性粒细胞浸润,减少局部组织中TNF-α、MCP-1的表达,进而影响炎症反应进程的持续时间。     

胸腺素α1对急性肝衰竭大鼠血浆TNF-α与IL-10的影响

目的探讨胸腺素α1(Tα1)对急性肝衰竭大鼠血浆TNF-α与IL-10的影响。方法构建急性肝衰竭大鼠模型后分组,干预组大鼠注射Tα1,检测不同时间点大鼠血浆ALT、AST、TBIL含量及血浆TNF-α、IL-10水平,获取的肝组织标本进行HE染色。结果(1)模型组及干预组ALT、AST、TBIL随时间均呈上升趋势,同一时间点,干预组ALT、AST、TBIL明显低于模型组(P<0.05)。(2)模型组及干预组肝组织均出现明显肝组织结构紊乱,肝细胞明显坏死,炎性细胞浸润等急性肝衰竭表现,且两组均随着时间不断加重。同一时间点,干预组肝细胞坏死程度较模型组轻,浸润的炎性细胞也较模型组少。(3)模型组及干预组TNF-α、IL-10均明显高于对照组(P<0.05)。模型组及干预组TNF-α、IL-10随时间均呈上升趋势。同一时间点,干预组TNF-α明显低于模型组;干预组IL-10明显高于模型组。结论 Tα1对急性肝衰竭大鼠具有保护作用,可明显改善肝细胞炎症及坏死,其机制可能与下调炎性细胞因子TNF-α水平,上调抗炎性细胞因子IL-10水平有关。     

血栓通注射液联合贝那普利对糖尿病肾病大鼠肾脏病理学及h-CRP、TNF-α表达的影响

目的观察血栓通注射液联合贝那普利对糖尿病肾病(DN)大鼠肾脏的保护作用,探讨其作用机制。方法用高糖高脂饲料加小剂量STZ制备DN大鼠模型,随机分为模型组(DN组)、贝那普利组(B组)、贝那普利加血栓通组(X组)、空白组(N组)。于实验12周末检测超敏C反应蛋白(h-CRP)、肿瘤坏死因子a(TNF-a),观察肾组织病理改变。结果与DN组相比,X组TNF-α、h-CRP水平明显降低(P<0.01),肾小球球囊增大程度减轻,基底膜增厚有所减轻,肾小球系膜扩张程度下降。与B组相比,X组TNF-α、h-CRP水平降低更显著(P<0.05),肾小球基底膜增厚及系膜细胞增生病变明显改善。结论血栓通联合贝那普利对DN大鼠的肾脏有明显的保护作用,其机制可能与降低炎性因子h-CRP、TNF-α的表达及抑制DN大鼠肾小球系膜基质增生及细胞外基质的沉积有关。     

重组人细胞角蛋白9 cDNA的原核表达及纯化

目的克隆人细胞角蛋白CK9的cDNA,通过原核表达系统表达融合蛋白并进行纯化和鉴定。方法从人角质形成细胞系(HaCaT)中提取RNA,以RT-PCR反转录cDNA,使用特异性引物PCR扩增出人CK9编码区全长并克隆到pET-28a载体上,再用IPTG诱导融合蛋白his-CK9的表达。表达的融合蛋白通过Ni 2+亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果测序鉴定构建表达载体中CK9的cDNA序列正确;融合蛋白his-CK9可在大肠杆菌中诱导表达;纯化的融合蛋白his-CK9纯度较高;纯化的融合蛋白his-CK9可与商品化CK9抗体特异性结合。结论成功构建原核表达载体pET-28a-CK9,并成功诱导及纯化融合蛋白his-CK9。     

脱氧胆酸对人食管腺癌细胞TNF-α、IL-8和IL-6表达的影响及其机制

目的探讨脱氧胆酸(DCA)对人食管腺癌OE19细胞中炎症因子的影响及机制。方法 MTT法观察不同浓度DCA(50、100、150、200、250、300μmol/L)在不同的作用时间(1、3、6、12、24h)对OE19细胞活性的影响;采用Realtime PCR和ELISA方法分析DCA对炎症因子mRNA和蛋白水平的影响,使用流式细胞术检测各组DCA干预后细胞内活性氧(ROS)水平改变,并与200μmol/L DCA+5mmol/L NAC(ROS清除剂N-乙酰半胱胺酸)组进行比较。结果在OE19细胞系中,DCA具有明显的细胞毒性作用,呈剂量-时间依赖性,并且200μmol/L DCA作用6h是其发挥生物学作用的初始浓度及有效时间。与对照组相比,DCA组TNF-α、IL-8和IL-6mRNA和蛋白表达增加,呈剂量依赖性。DCA也增加了细胞内ROS水平,呈剂量依赖性。NAC明显抑制DCA诱导的TNF-α、IL-8和IL-6的表达及ROS的释放。结论 DCA对OE19细胞有明显的细胞毒性及促炎作用,其促炎机制可能与细胞内ROS水平升高有关。     

黄芩苷对大鼠缺血再灌注脑组织TNF-α、IL-1β表达的影响

目的探讨黄芩苷对大鼠缺血再灌注脑组织TNFα、IL1β的表达和脑水肿及超微结构的影响。方法采用大脑中动脉缺血再灌注模型,先将大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组及黄芩苷治疗组,再用免疫组化法检测脑组织缺血再灌注3、6、24hTNFα和IL1β的表达,用称重法测定缺血再灌注3、6h脑组织含水量,电子显微镜观察缺血再灌注24h脑组织的超微结构及黄芩苷对其影响。结果TNFα和IL1β在缺血再灌注3、6、24h明显表达,黄芩苷治疗组的表达较之明显降低(P<0.01);缺血再灌注3、6h脑组织含水量明显增高,黄芩苷治疗组脑组织含水量较之明显降低(P<0.05,P<0.01);脑组织超微结构显示:神经细胞肿胀、损伤以及细胞迟发性死亡程度显著减轻。结论黄芩苷能降低脑缺血再灌注后TNFα、IL1β的表达,具有一定的脑组织保护作用。     

不同促排卵方案患者宫颈黏液中TNF-α与卵泡发育、排卵的相关性

目的探讨不同促排卵方案患者宫颈黏液(CM)中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平与卵泡发育及排卵的相关性。方法选择2004年2月至2005年1月在本院生殖内分泌研究室就诊的36例不孕妇女为研究对象,15名正常月经妇女为对照研究对象。共分三组,分别为克罗米酚组、尿促性素(HMG)和超促排卵(COH)组。于月经周期早卵泡期、围排卵期及黄体高峰期收集CM及血清,采用双抗RIA测定TNF-α水平及FSH、LH、E2、P水平,同时行阴道B型超声监测卵泡发育、子宫内膜厚度及排卵情况。结果①CM中TNF-α在正常月经周期及促排卵周期中存在周期性变化,卵泡期开始上升,围排卵期达高峰,进入黄体期后下降,其中围排卵期CM中TNF-α水平最高,差异有显著性(P<0.05);②CM中TNF-α与卵泡大小呈正相关(r=0.261,P<0.05),与子宫内膜厚度呈正相关(r=0.183,P<0.05),与CM评分无明显相关性;③排卵组与未排卵组CM中TNF-α比较,显示排卵组TNF-α水平明显高于未排卵组,差异有显著性(P<0.05)。结论CM中TNF-α在正常月经周期及促排卵周期中存在周期性变化,排卵期达高峰,有望作为预测排卵的另一指标;TNF-α在卵泡发育及排卵过程中起重要作用。     

IL-1β、TNF-α和NO水平变化在某些神经系统疾病中的意义

目的　探讨在高原条件下IL 1 β、TNF α及NO水平变化在某些神经系统疾病中的意义。方法　以多发性硬化 (MS)、格林 巴利综合症 (GBS)和帕金森氏病 (PD)患者为对象 ,用ELISA法测定血清及脑脊液中IL 1 β、TNF α和NO水平。结果　MS和GBS患者血清及脑脊液中的IL 1 β、TNF α及NO水平与对照组相比显著升高 (P <0 0 1 ) ;PD患者血清中该三种物质与对照组相比无明显变化 ,但脑脊液中的TNF α和NO明显高于对照组 (P <0 0 1 )。结论　提示IL 1 β、TNF α及NO在MS、GBS和PD发病机制中可能起着重要作用 ,它们之间也许存在一种网络调节关系。     

突变型人肿瘤坏死因子-α工程菌发酵培养的实验研究

目的　优化基因重组人突变型 4 71肿瘤坏死因子 α(TNF α)工程菌的发酵和表达条件。方法　通过改变培养基的组分、pH值、培养温度和诱导表达的条件等 ,采用测定细菌生物量和蛋白表达量等方法 ,确定最适的发酵和表达条件 ,并考察工程菌中重组质粒的遗传稳定性。结果　突变型 4 71rhTNF α工程菌在 pH值 7.5的SOC培养基中 ,30℃培养、4 2℃诱导 5h时 ,其表达量最大。而且 ,所构建的重组质粒在工程菌DH5α中传代稳定 ,目的蛋白的表达不受影响。结论　优化了基因重组人突变型 4 71rhTNF α工程菌的发酵和表达的最适条件 ,为进一步开发人突变型 4 71rhTNF α奠定了基础     

实验性肝硬化大鼠细胞因子IL-18、TNF-α、IFN-γ的变化及意义

目的 探讨在四氯化碳(CCl4) 复合因素诱导实验性肝硬化大鼠的形成过程中,白介素18(IL-18)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)的变化及意义.方法 将80只清洁级雄性SD大鼠随机分为正常对照组和造模2周组、4周组、6周组,每组20只.予以CCl4复合因素诱导大鼠肝硬化,并在2、4、6周3个时间点分别处死6只大鼠.采用ELISA法检测大鼠血清IL-18、TNF-α、IFN-γ和肝脏组织匀浆上清液中的IL-18含量;HE染色观察肝脏的组织病理学变化.结果 ①CCl_4复合因素诱导的实验性大鼠,组织病理学观察发现,2周时大鼠肝脏组织细胞肿胀变性,6周时有大量纤维增生,部分肝组织有假小叶的形成;②随着造模时间的延长,实验大鼠血清IL-18、TNF-α、IFN-γ水平逐渐升高,造模6周组与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);③造模组肝脏组织匀浆中IL-18随肝损害程度的加重而升高,造模6周组与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 在CCl_4复合因素诱导大鼠肝硬化的形成过程中,IL-18、TNF-α、IFN-γ水平逐渐升高,提示该3种细胞因子与肝硬化的形成及发展有关.     

TNF-α基因-308位点多态性与新疆维吾尔族、哈萨克族人群中支气管哮喘的关系

目的探讨TNF-α基因-308位点多态性与新疆维吾尔族、哈萨克族人群中支气管哮喘(BA)的相关性。方法以新疆维吾尔族、哈萨克族人群中BA发病组和对照组均60例为研究对象,通过PCR产物直接测序法检测TNF-α基因-308位点的多态性分布,并统计分析TNF-α不同基因型与新疆维吾尔族、哈萨克族人群中BA的相关性。结果维吾尔族、哈萨克族的BA发病组和对照组中均以GG基因型为主,在两民族人群中GG、GA、AA三种基因型频率有统计学差异(P<0.05),等位基因G和A之间亦有统计学差异(P<0.05);调整年龄、性别等影响因素后,两组之间仍有统计学差异(P<0.05)。结论 TNF-α基因-308位点的多态性与新疆维吾尔族、哈萨克族BA的易感性相关,携带AA或GA基因型患者发病风险较高。     

束缚应激对小鼠血浆α-klotho蛋白及肾脏α-klotho mRNA表达的影响

目的检测不同束缚应激条件下小鼠血浆皮质酮、α-klotho蛋白质量浓度及肾脏α-klotho mRNA表达的变化,分析α-klotho与束缚应激之间的关系,并探讨其在病态窦房结中可能的作用方式。方法本实验采用经典的束缚应激实验方法,运用血皮质酮浓度评估实验模型。将48只5周龄C57BL6/J小鼠分成1、10、20h组,每组设应激亚组和对照亚组,每亚组8只。运用ELISA方法测定血浆α-klotho蛋白和皮质酮浓度,实时定量PCR检测肾脏α-klotho mRNA表达的变化情况。结果束缚应激实验模型符合要求。1、10、20h对照亚组α-klotho蛋白质量浓度分别为(757.71±333.93)、(687.38±342.79)、(912.90±337.8)pg/mL;束缚应激亚组分别为(726.40±342.79)、(1 261.54±442.71)、(1 696.18±404.11)pg/mL。对照亚组各组之间质量浓度无统计学意义,但20h组较其他两组稍高。1h束缚应激亚组与对照亚组间无统计学差异,而10h与20h束缚应激亚组与其各自对照亚组间有统计学差异(P<0.05)。10h与20h束缚应激亚组肾脏α-klotho mRNA表达较空白对照亚组分别减低2.02倍和2.46倍。结论抗衰老基因α-klotho所表达的蛋白为急性期蛋白,束缚应激导致血α-klotho蛋白质量浓度升高的同时却减低肾脏α-klotho mRNA的表达;机体可能在应激条件下通过改变窦房结局部α-klotho蛋白质量浓度的方式,影响窦房结的功能。     

人GLUT4基因的克隆及原核表达的初步实验研究

目的　通过反转录聚合酶链方法 ,从人新鲜手术肌肉组织获得人葡萄糖转运子 4 (GLUT4 )cDNA基因 ,并分别克隆入测序载体、表达载体 ,获得具有正确序列的目的基因及其原核表达产物 ,为其进一步的抗体制备、活性鉴定及研究应用奠定物质基础。方法　经GenBank在线检索 ,设计、确定人GLUT4cDNA基因特异引物 ,采用反转录聚合酶链 (RT PCR)方法从一例手术的人新鲜腹部肌肉组织总RNA模板中 ,获得人GLUT4表达片段cDNA的基因 ,经克隆入测序载体pGEM 3zf(- )测序 ,验证cDNA大小、完整性及序列。再克隆入表达载体 pBV2 2 0 ,经温度诱导 ,在E .coli获得表达。结果　以设计的特异引物 ,从人肌肉组织模板中能得到预期大小完整的人GLUT4cDNA基因 ,并能插入预定的克隆载体中测序 ,所得基因的序列与目的基因的序列相符。所获GLUT4cDNA基因插入原核非融合表达载体pBV2 2 0 ,获得预期大小的重组表达产物。结论　从人肌肉组织中能获得具有正确序列、含完整起始及终止密码的人GLUT4cDNA基因。该人GLUT4cDNA基因的体外重组体能在原核表达系统表达     

TNF-α基因多态性与新疆哈萨克族慢性阻塞性肺疾病易感性的关系

目的探讨新疆哈萨克族慢性阻塞性肺疾病(COPD)与TNF-α基因-308位点(TNF-α-308)多态性的关系。方法以新疆哈萨克族150例COPD患者和150例健康体检者为研究对象,通过反向测序法对TNF-α-308的基因型进行检测,利用SPSS17软件分析该多态性位点与COPD易感性的关系。结果在COPD组和对照组中均以GG基因型为主,两组之间的GG、GA和AA基因型分布差异有统计学意义(P=0.004),等位基因G和A之间差异亦有统计学意义(P=0.001);经调整年龄、性别和吸烟史后,分析结果表明A等位基因是COPD发病的危险因素(P=0.001,OR=2.657,95%CI=1.552⁴.548)。结论哈萨克族人群TNF-α-308A等位基因可能是COPD发病的危险因素,携带GA或AA基因型患者发病风险较高。     

猴细小病毒Vp2的克隆、表达和鉴定

目的　克隆、表达和鉴定猴细小病毒 (simianparvovirus,SPV)Vp2蛋白。方法　用设计的SPVVp2区的特异性引物 ,PCR法扩增SPVVp2基因DNA片断 ;将获得的基因片断插入 pThioHisA载体中 ,转化大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆 ,利用限制性内切酶酶切和核酸序列分析技术鉴定重组质粒 ;以LB培养液培养转化有插入SPVVp2基因的pThioHisA载体的大肠杆菌 ,以终浓度 1mmol·L -1的IPTG诱导蛋白的表达 ;用SDA PAGE和Westernblot分析和鉴定表达的蛋白。结果　经限制性内切酶酶切和核酸序列分析 ,获得了插入pThioHisA载体框架的SPVVp2基因的表达质粒 ;阳性转化大肠杆菌在IPTG诱导下获得了SPVVp2蛋白的表达 ;SDA PAGE和用抗 Thio及抗 SPVVp2的特异性抗体的Westernblot分析证实了表达蛋白的特异性。结论　获得了SPVVp2基因的表达质粒并在大肠杆菌中得了高效表达 ,为进一步建立SPV感染的检测方法和研究SPV的血清流行病学等奠定了基础。     

肾上腺髓质素对大鼠肾脏损伤后AngⅡ及TNF-α表达的影响

目的 观察外源性肾上腺髓质素(ADM)对肾脏机械性损伤后血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达的影响,探讨其对肾脏损伤的保护作用.方法 健康成年普通级Wistar大鼠104只,随机分为4组:正常对照组(8只)、单纯创伤组(32只)、伤前给药组(32只)、伤后给药组(32只).后3组采用自由落体打击仪...     

SIK2 cDNA及其截短体原核表达重组体的构建及表达

目的构建SIK2cDNA及其截短体的原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达。方法分别设计SIK2及其截短体引物,采用PCR方法分别扩增SIK2、SIK2-Δ1(280⁹26)、SIK2-Δ2(400926)、SIK2-Δ2(400⁹26)、SIK2-Δ3(1926)、SIK2-Δ3(1⁴00)、SIK2-Δ4(700400)、SIK2-Δ4(700⁹26)五个cDNA片段,并将扩增的cDNA片段插入原核表达载体pGEX-4T-2,构建GST标签的重组质粒。将构建好的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导SIK2、SIK2-Δ1、SIK2-Δ2、SIK2-Δ3和SIK2-Δ4五个截短体的原核表达,用考马斯亮蓝染色和Western blot进行鉴定。结果成功构建了SIK2全长及其截短体cDNA的重组质粒,用考马斯亮蓝染色及Western blot鉴定显示,SIK2全长及其截短体重组质粒均在大肠杆菌中诱导表达。结论在大肠杆菌中成功地诱导表达了SIK2重组蛋白及其截短体,为进一步研究SIK2各结构域的功能提供了实验基础。     

反义HSP70真核表达载体的构建和在人喉癌细胞的表达

目的　进行促凋亡治疗喉癌实验 ,构建和鉴定携带反义HSP70 (heatshockprotein 70 )基因的真核表达载体。方法　将HSP70cDNA反向克隆入 pcDNA 3.1,构建CMV启动子控制的真核表达载体 pcDNA AHSP70 ,用酶切鉴定结果 ;应用该载体转染人喉表皮样癌细胞Hep 2 ,G4 18筛选阳性克隆 ;westernblot和免疫组化检测转染前后瘤细胞的HSP70的表达。检测转染前后瘤细胞的生物学性状。结果　获得 pcDNA AHSP70真核表达载体 ,HSP70反义RNA阻断了Hep 2细胞的HSP70的表达 ,经westernblotting和免疫组化证实 ,实验组瘤细胞不能表达或低表达HSP70 ,而对照和空载体组高表达HSP70。转染反义HSP70的真核表达载体的Hep 2细胞比空载体组和对照组的细胞生长缓慢 ,细胞周期可见实验组出现亚二倍凋亡峰 ,而空载体组没有。结论　本研究成功构建了反义HSP70真核表达载体并在人喉癌细胞得以表达。     

抗人精浆蛋白单链抗体基因在HeLa细胞中的表达和活性鉴定

目的　在HeLa细胞中表达抗人γ 精浆蛋白 (γ Sm)单链抗体 (scFv)基因 ,并进行亲和活性测定。方法　在已经构建抗人γ SmscFv基因基础上 ,将基因克隆入真核分泌表达载体 pSecTag2 B中 ,并转染HeLa细胞进行表达。表达产物纯化后 ,用流式细胞仪进行亲和活性测定。结果　表达产物经SDS PAGE和Western印迹实验证实为约30ku的特异蛋白条带 ,纯化后经流式细胞仪检测可以特异性地结合PC 3细胞。结论　获得了可与PC 3细胞特异结合的抗人γ SmscFv ,为进一步临床应用奠定基础