大骨节病人关节软骨和骺软骨的软骨细胞电镜观察

大骨节病的病理变化主要侵犯关节软骨和骺板软骨,表现为软骨的变性、坏死和修复性变化。在光学显微镜下,对软骨细胞的坏死和基质的变性变化已有较多的叙述。我们在探讨大骨节病软骨坏死的特点和发病机理时,曾注意到软骨细胞的变化居于重要的地位。进一步查明软骨细胞的病变,可能对探讨大骨节病的病因和发病原理有一定意义。为此,我们用透射电镜观察了大骨节病人关节软骨和骺软骨的软骨细胞超微结构。由于到目前为止,国内外对于本病还没有这方面的研究记述可资参考,因此本文只是初步的观察和分析。     

Legg-Perthes病关节软骨功能状态改变及其影响

目的　评价Legg Perthes病早期关节软骨功能状态及其对该病发展的影响。 方法　选择健康杂种幼犬 2 0只 ,雌雄不限 ,采用自身对照方法 ,任选一侧髋为实验侧 ,另一侧作为对照。应用TH胶股骨颈内注射法制作Legg Perthes病动物模型 ,于注胶后 8周、1 2周时幼犬分批处死取材 ,观察组织学变化 ,行软骨基质及软骨下骨蛋白多糖 (Proteoglycan ,PG)和碱性磷酸酶 (Al kalinephosphatase ,AKP)测定。 结果　随着实验时间延长 ,关节软骨病变与骨骺坏死病变逐渐加重 ,实验侧关节软骨增厚 ,早期即可观察到软骨细胞分布较稀散 ,软骨深层空缺软骨陷窝明显增多 ,软骨基质及软骨下骨PG含量显著下降 ,软骨下骨AKP活性明显降低。结论　Legg Perthes病时关节软骨功能早期已有明显障碍 ,其与股骨头骨骺坏死病变可相互促进 ,互相影响     

氟对培养的软骨细胞生长的影响

本文报道了氟对培养的软骨细胞生长的影响。传代兔关节软骨细胞在不同氟浓度培养液中培养192 h,结果显示:细胞生长和基质产生量均与氟浓度呈负相关。光镜形态观察各组间未见明显差异。     

家兔肋软骨膜移植再生关节软骨的实验研究

作者将14例家兔的肋软骨膜移植于剥去关节软骨的下颌髁状突骨床上,以电镜为主观察了自体软骨膜再生关节软骨的过程。结果见软骨形成开始于术后第14天,此时膜中出现软骨细胞,形成软骨基质;1月时软骨分层并开始改建,软骨细胞呈典型形态,伴有丰富的粗面内质网和高尔基氏器,提示其分泌活动旺盛;术后2月时细胞器减少;4～6月时软骨细胞呈现退变,而软骨形态已接近正常的关节软骨。作者还讨论了软骨膜移植物形成关节软骨以及软骨改建的机理。     

股骨下端骺软骨板血液供应的研究

用微血管造影及组织切片的方法,对9例2～15岁儿童和35只2～6周幼兔的股骨下端骺进行了观察。结果发现,在人体骺软骨板内有血管存在,它们主要来源于骨骺血管,行走于软骨管内,一般仅限于储备层内。但在2例儿童可以看到骨骺血管与干骺血管有交通。这一现象可以合理地解释一些骨病的X线表现规律。在幼兔,骺软骨板内的血管与人类似,但未发现骨骺与干骺间有血管交通。     

大骨节病儿童及成人关节软骨细胞凋亡特征的比较

目的探讨细胞凋亡及相关调控因子Bcl-2、Bax在大骨节病(KDB)儿童和成人关节软骨中的表达及分布的异同。方法收集15例大骨节病儿童和12例大骨节病成人,采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的脱氧核糖核酸缺口标记(TUNEL)技术和Bcl-2、Bax免疫组化抗生物素蛋白-生物素-碱性磷酸酶(B-SA)法染色,比较正常儿童和成人与大骨节病儿童和成人关节软骨中软骨细胞凋亡及相关调控因子Bcl-2和Bax的表达。结果KDB儿童关节软骨中层凋亡阳性细胞数较正常关节软骨显著增多(P<0.01);成人KDB关节软骨凋亡阳性细胞分布以表、中层显著(P<0.05)。②KDB儿童关节软骨表、中层Bcl-2、Bax的表达显著高于正常关节软骨中的表达(P<0.01),其中表层最高。③KDB成人关节软骨各层Bcl-2、Bax的表达显著高于正常关节软骨中的表达(P<0.05),其中表层最高。④KBD成人关节软骨各层凋亡细胞、Bcl-2、Bax阳性表达率均较KBD儿童显著增高,且Bax的表达较Bcl-2表达增多。结论KBD成人关节软骨凋亡细胞、Bcl-2、Bax阳性表达率均较KBD儿童显著增高,且Bax的表达较Bcl-2表达增多。     

胎儿和幼儿跖趾骨血液供应的观察

采用微血管造影等方法,观察30例胎、幼儿跖趾骨的血供。结果表明:胎儿期跖趾骨骨干和两端软骨逐渐增大,出现滋养动脉和软骨管,幼儿期两端软骨逐渐变小,软骨管也逐渐消失。提示软骨管的出现与软骨块的大小有关,软骨管是胎儿软骨内的临时血管系统。跖趾骨血供特点:①跖趾骨血供的不均称性分布,即骺端软骨血供丰富,这与两端生长能力不同相适应;②远趾只骺端有软骨管分布,这与只骺端有生长能力相适应,说明跖趾骨血供与其生长发育有密切关系。     

生长因子诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化的研究

目的　建立一种体外分离兔骨髓间充质干细胞 (MSCs)的方法 ,诱导其表达软骨细胞表型。方法　抽取兔骨髓 ,经密度梯度离心和粘附分离得到MSCs。用生长因子诱导 ,观察细胞的增殖情况和软骨特异性基质的表达水平。结果　①纤维粘连蛋白促进MSCs贴壁 ,可提高细胞分离率 ;②TGF β1 ,IGF Ⅰ和维生素C结合可促进MSCs增殖 ,表达软骨特异性的Ⅱ型前胶原mRNA和基质蛋白多糖成分。结论　①密度梯度离心结合粘附分离可提高MSCs的分离效率。②TGF β1 ,IGF Ⅰ和维生素C结合诱导可促进MSCs增殖 ,表达软骨细胞表型     

绿原酸对高强度运动引起的膝关节软骨损伤的保护作用

目的探讨绿原酸在高强度运动引起的大鼠膝关节软骨损伤中的保护作用及其可能的机制。方法将同龄SD大鼠随机分为3组:运动组、干预组和对照组。运动组和干预组大鼠每天在自制电刺激运动装置中进行一次持续40min的跳跃运动,中间休息10min,每周运动6d,休息1d;干预组在每日运动前,给予腹腔注射绿原酸;对照组无任何处理。4周后,取含左后肢膝关节液的生理盐水用ELISA法测定其中白介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)含量和MMP-3酶活性,并利用蕃红染色评估膝关节软骨损伤情况。结果与对照组相比,运动组大鼠膝关节软骨表面不光滑,出现很多微小裂隙,滑膜肿胀,软骨细胞增多紊乱,基质中糖胺多糖含量减少,关节液中IL-1β、TNF-α含量明显升高,MMP-3含量和酶活性均升高;而干预组大鼠膝关节软骨损伤程度较运动组轻,关节液中IL-1β、TNF-α含量、MMP-3含量和酶活性均低于运动组。结论绿原酸对高强度跳跃运动引发的膝关节软骨损伤具有一定的保护作用,抑制炎症因子介导的MMP-3活化可能是其发挥上述保护作用的主要机制之一。     

脱钙松质骨体外构建组织工程软骨的实验研究

目的软骨细胞复合同种异体脱钙松质骨(demineralized cancellous bone,DCB)体外构建组织工程软骨,评价DCB作为组织工程软骨支架的可行性。方法取新西兰兔长骨干骺端松质骨制备DCB,扫描电镜观察;分离幼兔关节软骨细胞,原代培养后种植在同种异体DCB体外培养,分别于7、14、21、28、35、42d取材进行苏木素-伊红(HE)、甲苯胺蓝(TB)、Ⅰ型和Ⅱ型胶原染色。结果制备的DCB成三维立体多孔结构,孔隙大小100~500μm,有良好的可塑性和一定的力学强度;软骨细胞在DCB表面和空隙内生长、分化良好,形成软骨陷窝,分泌基质蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。培养42d软骨细胞在DCB表面及孔隙内形成软骨样组织。结论 DCB复合同种异体软骨细胞在体外成功构建了组织工程软骨,是一种较理想的软骨组织工程支架材料。     

组织工程修复软骨基质蛋白聚糖代谢的初步探讨

目的 检测软骨修复组织中蛋白聚糖相关代谢指标,初步探讨在软骨修复过程中基质蛋白聚糖的代谢变化以及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和蛋白聚糖酶(aggrcanases)的作用.方法 松质骨骨基质明胶(bone matrix gelatin, BMG)复合同种异体软骨细胞构建组织工程化软骨,体内植入修复兔膝关节骨软骨缺损.术后6个月取材检测蛋白聚糖合成表位3-B-3(-)、MMPs、MMPs裂解表位BC-4 以及aggrcanases裂解表位BC-13的表达情况.结果 在修复组织中,蛋白聚糖合成表位3-B-3(-)表达增加,MMPs及其裂解表位BC-4表达减低,而aggrcanases裂解表位BC-13表达阴性.结论 利用蛋白聚糖合成表位3-B-3(-)、MMPs、BC-4、BC-13的表达情况可以初步了解修复软骨组织中蛋白聚糖的代谢变化,修复软骨组织蛋白聚糖的合成大于分解,MMPs在兔关节修复软骨基质蛋白聚糖的基础代谢和重塑中具有重要作用.     

大骨节病关节软骨细胞形态及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅹ型胶原表型和MMP-13表达的体外研究

目的体外培养大骨节病(Kashin-Beck disease,KBD)患者和正常对照的关节软骨细胞并对比观察细胞形态、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅹ型胶原表型及基质金属蛋白酶13(MMP-13)的表达变化,以明确KBD软骨细胞的生长特性。方法依据我国"大骨节病临床诊断标准"和病理学变化特征,选择KBD患者为KBD组(n=8),并设立正常对照组(n=8)。在无菌手术条件下采集关节软骨,胶原酶等消化、分离后进行软骨细胞培养,光镜及透射电子显微镜观察形态,免疫组织化学及流式细胞术观察细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅹ型胶原和MMP-13的体外表达变化,对比研究KBD软骨细胞表型表达的特点。结果KBD软骨细胞内空泡及核变形现象较正常增多,并有绒毛及胶原纤维不规则排列等超微结构变化。两组间Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅹ型胶原表型表达差异显著,其中KBD组Ⅱ型胶原表型表达显著低于对照组(t=-5.54,P<0.001),而MMP-13表达显著增高(t=3.70,P<0.01)。结论KBD软骨细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅱ、Ⅹ型胶原表型和MMP-13的表达不同于正常对照组,以软骨细胞的退行性和增生性变化为著。     

氧自由基对人胚软骨细胞DNA基质成分及超微结构的影响

本实验采用体外软骨细胞培养方法,观察由黄嘌呤—黄嘌呤氧化酶产生的自由基对人胚软骨细胞DNA、基质蛋白多糖、胶原合成功能及超微结构的影响。结果表明该酶系产生的自由基抑制人胚软骨细胞DNA、蛋白多糖、胶原的合成,对软骨细胞膜及细胞器具有明显的损伤作用,从而间接说明某些炎性关节疾病时活化中性粒细胞、巨噬细胞释放的氧自由基是引起关节软骨损伤的重要因素。     

大骨节病关节软骨细胞形态及工、Ⅱ、Ⅲ、X型胶原表型和MMP-13表达的体外研究

目的体外培养大骨节病（Kashin-Beckdisease,KBD）患者和正常对照的关节软骨细胞并对比观察细胞形态、I、Ⅱ、Ⅲ和X型胶原表型及基质金属蛋白酶13（MMP-13）的表达变化,以明确KBD软骨细胞的生长特性。方法依据我国“大骨节病临床诊断标准”和病理学变化特征,选择KBD患者为KBD组（n=8）,并设立正常对照组（n=8）。在无菌手术条件下采集关节软骨,胶原酶等消化、分离后进行软骨细胞培养,光镜及透射电子显微镜观察形态,免疫组织化学及流式细胞术观察细胞I、Ⅱ、Ⅲ、X型胶原和MMP-13的体外表达变化,对比研究KBD软骨细胞表型表达的特点。结果KBD软骨细胞内空泡及核变形现象较正常增多,并有绒毛及胶原纤维不规则排列等超微结构变化。两组间I、Ⅱ、Ⅲ、X型胶原表型表达差异显著,其中KBD组II型胶原表型表达显著低于对照组（t=-5．54,P〈O．001）,而MMP-13表达显著增高（t=3．70,P〈O．01）。结论KBD软骨细胞I、Ⅱ、Ⅱ、X型胶原表型和MMP-13的表达不同于正常对照组,以软骨细胞的退行性和增生性变化为著。     

IL-1β和MMP-13在兔骨关节炎模型软骨和滑液中的表达

目的评价兔膝关节内侧半月板损伤制作骨关节炎(OA)模型的方法的可行性,探讨白细胞介素-1β(IL-1β)和金属蛋白酶-13(MMP-13)在兔骨关节炎模型软骨和滑液病变中的作用机制。方法新西兰大白兔40只,随机分为实验组(n=30)和对照组(n=10),于术后2、6、12周观察股骨髁关节软骨的病理变化并进行评分;用免疫组化方法检测关节软骨中IL-1β和MMP-13的表达情况;用酶联免疫吸附法测定关节液中IL-1和MMP-13的含量。结果实验组和对照组在大体和病理观察不同时间点关节软骨评分及HE染色差异均有统计学意义(P<0.05)。免疫组织化学检测结果显示IL-1β在两组中均有表达,实验组和对照组2周时细胞分数差异无统计学意义,6、12周差异有统计学意义(P<0.05)。MMP-13在对照组关节软骨细胞中未见表达,实验组的关节软骨细胞中可见MMP-13蛋白的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。关节滑液中IL-1β表达和在软骨中表达一致。结论采用损伤兔膝关节半月板的方法可建立合理的动物OA模型;IL-1β和MMP-13在OA发病过程中表达水平有明显变化,需要进一步的临床研究来探讨其是否可以作为早期诊断OA的指标之一。     

线粒体细胞色素c介导的caspase-9激活通路参与大骨节病关节软骨细胞凋亡的发生机制

目的通过评价线粒体功能研究线粒体介导的caspase-9激活通路参与成人大骨节病关节软骨细胞凋亡的机制。方法关节软骨细胞培养,Hoechst 33258染色检测软骨细胞核形态,流式细胞仪检测软骨细胞凋亡率和细胞内活性氧含量,Western bloting检测细胞色素c的表达,荧光法检测caspase-9和caspase-3活性。结果大骨节病患者关节软骨细胞较正常软骨细胞凋亡百分率增加,线粒体细胞色素c释放,caspase-9和caspase-3活性增高,且活性氧含量增加。结论线粒体氧化应激参与了大骨节病软骨细胞的病理生理变化,线粒体功能障碍可能在大骨节病关节软骨细胞凋亡过程发挥了重要作用。     

胎儿软骨细胞体外培养过程中生长及代谢的变化

目的探讨体外培养的软骨细胞形态及Ⅰ、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达变化,为组织工程软骨种子细胞选择合适的回植时机。方法取体外培养的第1-5代胎儿软骨细胞,观察细胞形态和细胞增殖率;用爱茜蓝(alcianblue)法检测软骨细胞聚集蛋白聚糖中糖胺聚糖含量;分别用免疫细胞化学和逆转录聚合酶链反应检测Ⅰ、Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖在蛋白和mRNA水平的表达。结果体外培养的胎儿软骨细胞从第3代起逐渐向成纤维样细胞转换;各代软骨细胞糖胺聚糖的含量随传代次数的增加而逐渐降低,第3代后处于较低水平;第2代以前Ⅱ型胶原表达较强,Ⅰ型胶原表达较弱,之后随传代Ⅱ型胶原表达减弱,Ⅰ型胶原表达逐渐增强;而聚集蛋白聚糖在第3代以前表达较高,从第4代后明显下降。结论人胎儿软骨细胞体外培养过程中,第2代软骨细胞从形态和功能上最接近体内状况,可作为软骨组织工程的种子细胞。     

牛关节软骨培养稳态模型的实验研究方法

参照Ｈａｓｃａｌｌ实验方法建立了牛关节软骨体外培养，并通过组织学观察，３５Ｓ掺入率测定及已糖醛酸测定的方法证明在加入２０％小牛血清的ＤＭＥＭ培养液中，培养７ｄ后，软骨蛋白多糖的代谢达到了稳态，这为研究关节软骨蛋白多糖代谢及其影响因素提供了一个较好的实验模型。     

T-2毒素对软骨细胞整合素表达的影响及硒的拮抗作用

目的研究T-2毒素和硒对软骨细胞整合素mRNA表达的影响,探讨T-2毒素和硒与大骨节病发病的关系。方法体外单层培养C-28/I2软骨细胞,用MTT法测定细胞在不同浓度T-2毒素和不同作用时间下的增殖活性,通过Real-time PCR法检测软骨细胞在加T-2毒素或补硒后整合素α1、α2、α3、β1、β3、β5等10种亚基的表达情况。结果 T-2毒素可抑制C-28/I2软骨细胞系的增殖活性,在T-2毒素作用下软骨细胞系中整合素的表达谱有显著变化,其中显著上调的整合素亚基有αv和β1,下调的亚基有α2、α5和β5,加硒可在一定程度上拮抗这种改变。结论 T-2毒素对软骨细胞增殖有明显的抑制作用,而硒能通过拮抗整合素的表达而发挥对软骨细胞的保护作用。     

海藻酸盐小球中培养的软骨细胞的生长

目的为海藻酸盐水凝胶作为软骨细胞三维培养环境提供实验依据。方法将酶消化法获取的P1代软骨细胞包裹在20 g/L海藻酸钙凝胶小球中持续培养4周,在培养的不同时间点取适量的小球行倒置相差显微镜观察,HE、番红"O"染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色;并通过MTT法检测细胞活性及增殖;二甲基亚甲兰法进行氨基葡聚糖(GAG)含量测定。结果在海藻酸钙小球内培养的软骨细胞能够保持球形状态,且随时间的延长,细胞增殖逐渐聚集成簇;细胞外基质沉积逐渐增加,GAG含量增多。Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,鉴定证实为具有正常表型的软骨细胞。结论软骨细胞在海藻酸盐凝胶小球中培养有效维持了细胞的分化状态,细胞增殖并具有良好的分泌蛋白功能。海藻酸钙凝胶适合于软骨细胞的生长。