miR-497靶向调控疾病易感基因EFNB2的分子机制研究

目的用分子克隆和双荧光素酶报告基因的方法研究miR-497对精神分裂症易感基因EFNB2的靶向调控作用,为miR-497在精神分裂症中的分子功能研究奠定基础。方法运用生物信息学在线软件预测,发现与精神分裂症相关的miR-497可能直接调控疾病易感基因EFNB2。随后采用分子生物学技术扩增EFNB2基因3′-UTR中包含与miR-497种子序列相结合的片段,将该片段连接入pmirGLO质粒载体构建野生型的重组体(WT),并突变EFNB2基因3′-UTR与种子序列相结合的碱基序列,构建突变型的重组体(MUT)。最后将miR-497阴性对照(NC)和模拟物(mimics)分组转染HEK293T细胞系,并在24、48h后分别进行双荧光素酶报告基因活性测定。结果测序结果表明EFNB2基因3′-UTR的野生型(WT)和突变型(MUT)分别成功构建入pmirGLO载体中,表明WT和MUT的重组体均构建成功。转染24、48h后的双荧光素酶报告基因活性检测结果表明,miR-497mimics与NC相比,显著性降低了报告基因的活性。结论本研究在细胞水平证明了miR-497可直接调控精神分裂症易感基因EFNB2,为后续miR-497在精神分裂症中的功能研究提供了新思路和新线索。     

hGPx-1-198Leu真核表达载体的构建与鉴定及在H9C2细胞中的表达

目的构建含有人GPx-1基因Pro198Leu多态的真核表达载体,为深入研究GPx-1基因Pro198Leu多态在相关疾病中的作用与机制提供依据。方法采用全基因合成的方法合成含多态位点的人GPx-1基因cDNA片段,同时在基因5′端和3′端分别引入BamHⅠ和NotⅠ酶切位点,通过限制性内切酶酶切目的片段和真核表达载体pEGFPN3,再用T4DNA连接酶将含有目的基因的片段定向插入到载体pEGFP-N3真核人巨细胞病毒启动子下游。连接产物转化至DH5α中。挑取克隆、提取质粒进行鉴定。将hGPx-1-198Leu真核表达载体转染HEK293细胞,观察转染效率,并采用RT-PCR检测转染重组载体后细胞中GPx-1的mRNA表达水平。重组载体转染H9C2细胞,观察补硒之后的GPx-1表达情况。结果获得目的基因cDNA片段全长869bp,PCR和测序鉴定载体中含有人GPx-1-198Leu基因cDNA。重组载体转染HEK293细胞后检测到GPx-1的mRNA水平比未转染组及空质粒转染组明显升高,为深入研究GPx-1基因Pro198Leu多态在相关疾病中的作用与机制奠定了基础。H9C2细胞在转染后GPx-1蛋白水平升高并且随着硒浓度的升高而升高。结论成功构建了含Pro198Leu多态位点的hGPx-1真核表达载体,并且也插入了保证该基因有效表达的硒代半胱氨酸插入序列。     

表达US3基因腺病毒载体下调CTL和NK细胞对其转染肝细胞杀伤活性的影响

目的研究表达US3基因重组腺病毒载体对其转染肝细胞介导的免疫逃逸活性。方法首先构建表达US3基因腺病毒载体,扩增纯化后转染HL-7702肝细胞,利用细胞毒性T细胞(CTL)杀伤实验和自然杀伤细胞(NK)杀伤实验,检测表达US3基因重组腺病毒载体的免疫活性。结果表达US3基因的重组腺病毒r-US3成功构建,r-US3能够明显降低CTL和NK细胞对转染肝细胞的杀伤活性。结论表达US3基因腺病毒载体在一定程度上能够介导转染肝细胞的免疫逃逸,降低机体免疫系统对转染肝细胞的排斥反应。     

通用腺伴随病毒载体的构建及表达报告基因GFP的实验研究

目的构建基因治疗通用型腺伴随病毒(AAV)载体并检测其转染外源基因作用。方法使用限制性内切酶切除pSSV9int质粒中的AAV病毒Rep和Cap基因元件后,插入了重组腺病毒专用穿梭质粒-pACCMVpLpA的含有CMV启动子、多克隆位点(MCS)和多聚腺苷酸信号(PolyA)的表达盒,构建了重组AAV通用载体质粒pSSHG-CMV。在该质粒MCS插入绿色荧光蛋白(GFP)基因后,使用pSSHG-CMV-GFP、GFP140和pAAV/Ad三种质粒共转染293包装细胞,制备GFP重组AAV。应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度,并将该病毒感染新生大鼠NIH3T3细胞,荧光显微镜观察GFP表达。结果重组AAV的滴度在浓缩前可达2×1011cfu/mL,浓缩后可达2×1013cfu/mL,表明成功地构建了重组AAV载体。插入外源基因GFP后,在包装病毒和辅助质粒的联合作用下,能产生具有感染性的重组AAV。感染了重组GFP-AAV的大鼠NIH3T3细胞表达了明显的GFP荧光。结论构建的重组AAV通用载体pSSHG-CMV可转染外源基因,这为进一步的基因治疗奠定了基础。     

人神经菌毛素-1基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建含有人神经菌毛素-1(NRP-1)基因和3Flag标签蛋白基因的腺病毒载体,为研究该基因对肿瘤细胞与其周围间质细胞的相互作用的影响提供实验基础。方法应用AgeⅠ和NheⅠ限制性内切酶酶切含有人NRP-1基因的质粒,再将其与酶切线性化的pDC315-3Flag载体片段连接,构建穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag;应用腺病毒骨架质粒pBHGlox△E13Cre与此穿梭质粒共转染HEK293细胞,产生重组腺病毒,进而对重组腺病毒进行扩增、纯化及滴度测定;用PCR和基因测序方法验证穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag的构建;再通过荧光显微镜和Western blot方法,分别检测质粒pDC315-NRP-1-3Flag和重组腺病毒转染HEK293细胞后NRP-1蛋白的表达情况。结果经PCR和测序分析,证实穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag与设计一致;穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag和重组腺病毒分别转染HEK293细胞后,经Western Blot均检测出在95¹30ku处有条特征带,其大小和NRP-1-3Flag融合蛋白(104ku)相吻合;滴度测定为2.00E+11PFU/mL。结论成功构建了人NRP-1基因重组腺病毒载体,并能在HEK293细胞中表达。     

miR-106b对鼻咽癌细胞凋亡的促进和对增殖的抑制作用

目的探讨miR-106b对鼻咽癌细胞凋亡和增殖的影响。方法应用miRNA芯片分析获得鼻咽癌组织和癌旁正常组织表达差异的miRNA,TaqMan miRNA检测试剂盒和实时荧光定量PCR分别检测miR-106和RhoC mRNA在鼻咽癌和癌旁组织中的表达,用miRnada预测miR-106b和靶基因的结合位点,采用双荧光素酶验证靶基因,Western blot检测miR-106b调控靶基因RhoC的表达水平。用Annexin V-PI和TUNEL检测miR-106b对鼻咽癌细胞凋亡的影响,用MTT检测miR-106b对鼻咽癌细胞增殖的影响。结果 miRNA芯片分析发现鼻咽癌组织中miR-106b的表达较癌旁正常组织低。RT-PCR结果显示miR-106b在鼻咽癌组织中表达减少(P<0.05),RhoC在鼻咽癌组织中表达增加(P<0.05),miR-106b和RhoC在鼻咽癌组织中表达呈负相关(r=―0.586 6,P<0.001)。荧光素酶报告基因实验结果显示miR-106b组荧光素酶活性低于空质粒组(P<0.05),Western blot结果显示miR-106b组鼻咽癌细胞中RhoC的表达较空质粒组降低(P<0.05)。Annexin V-PI和TUNEL结果显示,miR-106b组鼻咽癌细胞凋亡较空质粒组增加(P<0.05);MTT结果显示miR-106b组鼻咽癌细胞增殖能力较空质粒组降低(P<0.05)。结论 miR-106b可能通过下调RhoC的表达诱导鼻咽癌细胞凋亡并抑制鼻咽癌细胞增殖。     

靶向RWDD3基因shRNA慢病毒载体的构建及功能鉴定

目的构建RWD结构小泛素化增强子(RWDD3)shRNA慢病毒表达载体,为探讨RNA干扰技术抑制人脑胶质瘤细胞RWDD3基因的相关研究奠定基础。方法设计RWDD3的3条siRNA的靶点序列,合成含干扰序列的双链DNA发卡结构shRNA,分别与双酶切后的载体连接,构建3种重组质粒pGC-LV-shRNA1、pGC-LV-shRNA2和pGC-LV-shRNA3,并转化于DH5α感受态细胞,提取阳性克隆质粒测序,转染293T细胞,生产慢病毒颗粒,并检测病毒滴度。将3种重组慢病毒及阴性对照病毒分别感染人脑胶质瘤细胞U251,实时定量PCR和Western blot分别检测RWDD3mRNA和蛋白的沉默效果。结果测序结果证实3种慢病毒载体均包装成功,滴度分别为5×10~(11) TU/L、4×10~(11) TU/L、5×10~(11) TU/L。感染U251后,RWDD3mRNA及蛋白的表达量均较阴性对照组和未感染组明显降低(P<0.05);其中以LV-RWDD3-shRNA-1作用显著,mRNA表达下调79.2%,蛋白表达下调68.2%(P<0.05);而阴性感染对照组和未感染组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建3种RWDD3shRNA慢病毒表达,可有效下调U251细胞RWDD3mRNA和蛋白的表达,其为进一步研究以RWDD3为靶点的脑胶质瘤基因治疗提供稳定转染细胞的载体奠定基础。     

大鼠PER2基因RNAi慢病毒载体的构建及干扰效率的测定

目的构建及筛选有效干扰大鼠血管平滑肌细胞PER2基因的shRNA慢病毒载体,并测定其干扰效率。方法设计大鼠PER2的siRNA靶序列,插入慢病毒载体质粒pGLV-U6-EGFP中,构建pLentivirus-per2-rat表达重组体并转染至A7r5大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞内,利用Real-time PCR方法检测PER2基因的mRNA表达水平,筛选有效沉默钟基因PER2表达的RNAi慢病毒载体。结果经电泳、基因测序证实插入的目的序列正确,有PER2表达,成功构建了pLentivirus-per2-rat表达重组体;转染慢病毒载体pLentivirus-per2-rat至A7r5大鼠胸血管平滑肌细胞,测定转染效率达70%;Real-time PCR检测PER2基因的mRNA相对表达量,筛选出有效干扰大鼠血管平滑肌细胞钟基因Per2表达的siRNA片段,使PER2mRNA表达量下调约84%。结论成功构建了大鼠PER2的RNAi慢病毒载体,为进一步研究时钟基因的功能奠定了基础。     

pEGFP-N1-TNFα表达载体的构建与鉴定

目的构建pEGFP-N1-TNFα重组质粒并鉴定,为转导CIK细胞并定位表达奠定基础。方法以pMD19Sim-ple T-TNFα为模板,PCR扩增TNFαCDS区片段,将PCR产物进行15g/L琼脂糖凝胶电泳,并回收TNFα条带,用BglⅡ和HindⅢ将TNFα的PCR片段及目的载体pEGFP-N1双酶切,然后进行连接。连接产物转化至DH5α中。挑取克隆,提质粒,进行鉴定。结果 PCR扩增片段、双酶切出现722bp大小的目的基因条带与预期结果相符;插入片断测序结果与合成的寡核苷酸序列一致。结论成功构建了重组质粒pEGFP-N1-TNFα,为下一步用纳米材料转染CIK细胞的研究奠定了基础。