人促甲状腺激素受体胞外段的体外重组、蛋白高效表达及其与构象功能的关系

目的　TSH受体 (TSHR)是诱发自身免疫性甲状腺病 (autoimmunethyroiddisease ,AITD)的主要自身抗原。TSHR上TSH结合部位、自身抗体及主要的B细胞、T细胞表位均位于其胞外段部分。本研究利用基因重组方法 ,建立人TSH受体胞外段 (hTSHRecd)体外高效表达、纯化系统 ,用于Graves’病的临床及实验研究 ,探索体外表达的重组hTSHRecd蛋白的免疫生物活性与其空间构象的关系。方法　设计 1对hTSHRecd特异性引物 ,自PCRTTM3 hTSHR载体中PCR扩增合成hTSHRecd片段 ,经限制性内切酶BamHⅠ、SalⅠ消化 ,胶回收纯化后 ,重新构建于表达质粒 pQE 30中。用质粒电泳、限制性内切酶消化、PCR 3种方法鉴定重组质粒是否构建正确 ,并于E .coliM15细胞进行诱导表达。所表达的 6×His hTSHRecd融合蛋白经 12 0 g·L-1SDS PAGE ,Westernblotting鉴定。细菌培养产物经超声波破碎、裂解液裂解后利用Ni NTA树脂 ,经金属螯合层析法纯化 ,并经原位再折叠、透析、浓缩等处理。以ELISA、12 5I TSH结合抑制试验检测纯化蛋白与Graves’甲亢患者血清及TSH的结合活性。结果　经鉴定 ,重组质粒中含有以正确方向插入的 12 0 5bp的hTSHRecdcDNA基因片段。hTSHRecd融合蛋白约 4 7kD ,于 12 0 g·L-1SDS PAGE可见深染的特异性蛋白条带 ,可与Graves?     

人促甲状腺素受体膜外区基因克隆及真核表达

目的 克隆人促甲状腺激素受体胞外段基因,构建重组真核表达质粒,获得具有免疫学活性的纯化重组蛋白.方法 应用RT-PCR技术从人甲状腺组织得到TSHR膜外区cDNA,插入真核表达载体pcDNA3.1(+),转染CHO细胞,RT-PCR鉴定基因转录,用免疫细胞化学染色法和Western Blot鉴定表达蛋白.结果经测序证实筛选得到的重组体中存在序列正确的TSHR膜外区基因,表达蛋白具有免疫活性.结论成功克隆了人促甲状腺素受体膜外区基因和构建了真核表达载体,并将其在真核细胞中成功表达.     

猪源性CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 为进行基因转移阻断T细胞共刺激通路诱导异种胰岛细胞移植免疫耐受的研究,构建携带猪源性CTLA4Ig融合基因的重组腺病毒载体.方法 分离猪外周血单个核细胞,经RT-PCR扩增pCTLA4胞外段基因.将PCR产物克隆入pGH IgG,阳性克隆以双酶切及测序鉴定.将目的融合基因pCTLA4Ig克隆人腺病毒穿梭载体pSh...     

CHD4蛋白截短体融合蛋白的表达、纯化和鉴定

目的构建CHD4/Mi-2β基因的截短体原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达并对GST融合蛋白进行纯化和初步鉴定。方法采用PCR方法扩增CHD4/Mi-2β的染色质调节区(CHD4-C)、解螺旋酶模序(CHD4-H)及DNA结合区(CHD4-D)基因片段,将目的基因片段插入原核表达载体pGEX-5T构建带GST标签的重组质粒,阳性克隆行DNA序列测定。IPTG诱导GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H原核表达,谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白,并对融合蛋白Western blot鉴定。结果构建了3个CHD4/Mi-2β基因的截短体重组质粒;IPTG诱导显示,GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H融合蛋白主要以可溶性蛋白形式在细胞裂解液上清中表达,表达产物的相对分子质量分别为130、110、90ku。谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白,纯化产物的纯度最高可达94.5%。Western blot证实各融合蛋白与抗GST单克隆抗体发生特异性结合反应,分子质量与估计值相符,提示为GST融合表达的CHD4/Mi-2β截短体蛋白。结论成功纯化了较高纯度的GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H融合蛋白,为进一步研究CHD4蛋白在染色质重塑中的作用奠定了实验基础。     

人白介素24cDNA克隆、突变纠正和原核表达

目的获取人白介素24(IL-24)cDNA,构建原核表达载体以表达含有谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白GST-IL-24。方法以人外周血单核细胞(PBMC)总RNA为模板,RT-PCR扩增IL-24 cDNA,克隆入原核表达载体pGEX-4T-2,测序结果显示在IL-24 cDNA第223位G→A,370位T→C,从而导致其编码蛋白的氨基酸发生改变:A75T,H124Y,通过二次PCR将其纠正,重组载体pGEX-IL-24转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基--βD-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE,Western blot检测显示有融合蛋白GST-IL-24表达。结果通过RT-PCR及二次PCR得到人IL-24 cDNA,构建其原核表达载体,经IPTG诱导在相对分子量约为50 000处有融合蛋白表达。结论IL-24的重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)可以表达GST-IL-24融合蛋白。     

人GLUT4基因的克隆及原核表达的初步实验研究

目的　通过反转录聚合酶链方法 ,从人新鲜手术肌肉组织获得人葡萄糖转运子 4 (GLUT4 )cDNA基因 ,并分别克隆入测序载体、表达载体 ,获得具有正确序列的目的基因及其原核表达产物 ,为其进一步的抗体制备、活性鉴定及研究应用奠定物质基础。方法　经GenBank在线检索 ,设计、确定人GLUT4cDNA基因特异引物 ,采用反转录聚合酶链 (RT PCR)方法从一例手术的人新鲜腹部肌肉组织总RNA模板中 ,获得人GLUT4表达片段cDNA的基因 ,经克隆入测序载体pGEM 3zf(- )测序 ,验证cDNA大小、完整性及序列。再克隆入表达载体 pBV2 2 0 ,经温度诱导 ,在E .coli获得表达。结果　以设计的特异引物 ,从人肌肉组织模板中能得到预期大小完整的人GLUT4cDNA基因 ,并能插入预定的克隆载体中测序 ,所得基因的序列与目的基因的序列相符。所获GLUT4cDNA基因插入原核非融合表达载体pBV2 2 0 ,获得预期大小的重组表达产物。结论　从人肌肉组织中能获得具有正确序列、含完整起始及终止密码的人GLUT4cDNA基因。该人GLUT4cDNA基因的体外重组体能在原核表达系统表达     

G250抗原肽与HBcAg融合基因原核表达载体的构建及表达蛋白的免疫分析

目的构建肾癌G250抗原肽与HBcAg重组基因的原核表达质粒pET28a(+)/C-G250肽-C,并通过大肠杆菌进行原核表达并纯化,分析表达融合蛋白的免疫原性及抗原性。方法 PCR扩增编码G250抗原中249～268氨基酸的基因片段,将G250肽插入去除主要免疫优势区的重组质粒pGEMEX/HBcAg中,获得重组质粒pGEMEX/C-G250肽-C,为更换酶切位点,以pGEMEX/C-G250肽-C为模板,PCR扩增C-G250肽-C基因片段,最终将目的基因亚克隆入原核表达质粒pET28a(+)中,IPTG诱导融合蛋白表达,利用Ni 2+-NTA亲和层析法纯化重组融合蛋白,SDSPAGE鉴定融合蛋白的表达,纯化后融合蛋白经腹腔注射免疫BALB/c小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清中抗体的滴度。结果酶切及基因测序鉴定证实融合基因正确重组于表达质粒pET28a(+)中,原核表达并纯化后,该分离纯化融合蛋白纯度达95%以上,其相对分子质量约为22.35。BALB/c小鼠经4次免疫后,所有小鼠血清中均可检测到抗体,免疫第6周其血清中抗体滴度可达到1∶5.12×105,抗G250肽抗体滴度达到1∶6.4×104,抗HBcAg抗体滴度不超过1∶4×103。结论成功构建肾癌G250抗原肽与HBcAg重组基因原核表达质粒pET28a(+)/C-G250肽-C,在大肠杆菌中可高效表达,纯化后融合蛋白具有较强的免疫原性,能诱导小鼠产生高滴度和高特异性的抗体。     

β-淀粉样肽与乙型肝炎核心抗原融合基因Aβ-HBcAg表达载体的构建

目的　构建 β 淀粉样肽 ( β amyloidpeptide ,Aβ)与乙肝核心抗原 (HBcAg)融合基因Aβ HBcAg的原核表达载体 pBV2 2 0 /Aβ HBcAg ,为阿尔茨海默病基因工程疫苗的研究和制备奠定基础。 方法　采用非对称互补引物 /模板法 ,制备两端含有酶切位点的Aβ1- 42肽的cDNA ,将其连接到删除了Pre C区的HBcAg亚型ayw基因的N端组成融合基因Aβ HBcAg ,再将该融合基因亚克隆于载体 pBV2 2 0 ,构建为原核表达载体pBV2 2 0 /Aβ HBcAg。 结果　经DNA测序 ,限制性内切酶酶切等方法证实已成功地将Aβ1- 42cDNA重组到HBVcore的N端 ,并将融合基因亚克隆于 pBV2 2 0内。 结论　成功构建了原核表达载体 pBV2 2 0 /Aβ HBcAg。     

亚洲带绦虫膜联蛋白B2基因的表达、纯化及免疫学分析

目的 对亚洲带绦虫膜联蛋白B2(Annexins B2)进行克隆表达及免疫学初步研究.方法 利用在线生物信息学工具从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出Annexins B2基因,并将该基因克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL21/DE3中诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化,纯化的重组蛋白用Western blotting进行免疫学分析.结果 PCR、双酶切及重组质粒DNA测序均显示重组体构建成功,并得到高纯度的蛋白,且该重组蛋白可被亚洲带绦虫、猪带绦虫及牛带绦虫患者的血清识别.结论 亚洲带绦虫成虫Annexins B2基因可在原核表达系统中获得具有免疫活性的高效表达.     

亚洲牛带绦虫成虫延伸因子-1基因的表达、纯化及免疫学分析

目的 对亚洲牛带绦虫成虫延伸因子-1(elongation factor 1,EF-1)基因进行克隆、表达和免疫学初步研究.方法 将亚洲牛带绦虫成虫EF-1克隆到原核表达质粒pET-28a( )中,在大肠杆菌BL-21/DE3中用异丙硫代-β-D半乳糖苷诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,用蛋白印迹法(Western blotting)进行免疫学分析.结果 PCR、双酶切及DNA测序结果 均表明重组质粒pET-28a( )-EF-1构建成功.重组蛋白可被感染了亚洲牛带绦虫患者血清和猪血清识别,表明其具有免疫反应性.结论 亚洲牛带绦虫成虫EF-1基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础.     

NT4-ADNF-9融合基因原核表达载体的构建

目的　构建神经营养素 (NT4 )与活性依赖性神经营养因子 9(ADNF 9)融合基因的原核表达载体pBV2 2 0 /NT4 ADNF 9,为进一步对神经系统退行性疾病基因治疗的研究奠定基础。方法　采用非对称互补引物 /模板法 ,制备两端含有酶切位点的ADNF 9的cDNA ,将其连接到NT的信号肽和前导序列的 3′端 ,组成融合基因NT4 ADNF 9,再将该融合基因亚克隆于原核表达载体pBV2 2 0 ,构建为pBV2 2 0 /NT4 ADNF 9。结果　经DNA测序 ,限制性内切酶酶切等方法证实已成功地将ADNF 9重组到NT4信号肽和前导序列的 3′端 ,并将融合基因亚克隆于pBV2 2 0内。结论　成功构建了NT4与ADNF 9融合基因的原核表达载体pBV2 2 0 /NT4 ADNF 9。     

人杀菌渗透增强性蛋白N末端片段在大肠杆菌中的表达

目的构建表达人杀菌渗透增强性蛋白(BPI)N-端193个氨基酸的重组表达质粒,诱导表达BPI193重组蛋白。方法应用RT-PCR的方法从HL-60细胞内扩增出BPI氨基端1-193个氨基酸的基因序列,克隆入T载体。将BPI193基因片段定向克隆入原核表达载体PET-28a中,构建重组的原核表达质粒PET-BPI193,转化大肠杆菌BL21菌株,用IPTG诱导表达蛋白。应用SDS-PAGE检测蛋白表达情况,计算机薄层扫描分析蛋白占菌体总蛋白百分比;Western-blot技术检测表达蛋白的特异性。结果从HL-60细胞中扩增得到579bp的BPI193基因片段,构建了T-BPI193亚克隆和PET-BPI193重组表达质粒。转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导,经SDS-PAGE检测表明,成功表达了6His-BPI193融合蛋白。计算机薄层扫描分析表达量占菌体总蛋白的12%。Western-blot检测显示表达产物具有特异性。结论成功构建了PET-BPI193重组表达质粒。在大肠杆菌BL21内,诱导获得了BPI193与组氨酸融合表达的重组蛋白。     

丙型肝炎病毒1b DY株ns5a基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆和表达丙型肝炎病毒（HCV）1b型地方株DY株ns5a基因。方法运用原核细胞基因工程技术。设计目的基因的特异引物，采用巢式PCR法，从含HCV1bDY株全长eDNA的质粒HCV17中扩增出约480bp的目的片段，将其插入克隆载体pMD18-Tvector中，再亚克隆到原核表达载体pET-28a中；经酶切、PCR及测序鉴定后转化入BL21菌株，在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达；采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测NS5A蛋白的表达水平。结果成功构建了含有HCV1b DY株ns5a基因的重组体，并得以表达。结论成功构建和表达了HCV1b DY株ns5a基因，为进一步研究HCVns5a的基因型及探讨该基因编码的Ns5A蛋白的性质和生物学活性创造了条件。     

CD25分子胞外段基因免疫应答中B淋巴细胞的变化及意义

目的 用鼠CD25分子胞外段基因疫苗免疫Balb/c小鼠,观察其诱导的体液免疫应答中B淋巴细胞的变化并探讨其意义.方法 用pcDNA3.1-CD25胞外段真核表达质粒分别在第0天、第10天和第20天肌肉注射免疫同系Balb/c小鼠,酶联免疫法(ELISA)检测抗CD25胞外段的抗体水平及亚型,FACS检测脾细胞中B淋巴细胞的比例变化及细胞因子IL-4、IL-10和IFN-γ的表达变化.结果 与对照组相比,CD25胞外段基因免疫组小鼠血清抗CD25抗体在免疫后逐渐升高,第30天达最高峰;抗CD25抗体主要以IgG1为主;免疫小鼠脾细胞中B细胞的比例变化不显著(P>0.05),但高分泌IL-4和IL-10(P<0.05),而低分泌IFN-γ(P<0.05).结论 CD25胞外段蛋白基因免疫中B细胞功能变化显著,这为后续深入研究体液免疫应答在T细胞疫苗中的作用提供了前期实验基础.     

EGFR、Ku70、NF-κB及Bcl-2在Graves病中的表达及意义

目的研究Graves病患者细针穿刺组织中EGFR、Ku70、NF-κB和Bcl-2基因的表达水平,探讨其在Graves病发生发展中的作用。方法 Graves病组患者59例,平均年龄(44.66+12.94)岁,其中男16例,女43例;甲状腺结节周围正常甲状腺组织标本27例为对照组,平均年龄(44.64+14.27)岁,其中男6例,女21例。采用实时荧光定量逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)法检测EGFR、Ku70、NF-κB和Bcl-2在Graves病及对照组甲状腺组织中的表达,t检验分析基因表达水平差异;Pearson相关法分析基因表达与临床特征及相关血清学指标之间的关系。结果上述基因在对照组及Graves病甲状腺组织中都有不同程度的表达。Graves病患者组织中EGFR及Ku70的表达水平明显高于对照组甲状腺组织(1.752±0.660 vs.0.859±0.125,P<0.05;3.304±0.402 vs.0.768±0.102,P<0.001);NF-κB及Bcl-2的表达水平明显低于对照组甲状腺组织(0.578±0.066 vs.0.884±0.085,P<0.001;0.834±0.086vs.1.235±0.261,P<0.05)。Graves病组织中NF-κB与Bcl-2表达水平呈正相关(r=0.399,P<0.001)。Graves病组织中Ku70的表达水平与血清TgAb水平呈正相关(r=0.263,P<0.05),而其他基因表达与相关血清学指标无关(P均>0.05)。结论 Ku70、EGFR、NF-κB、Bcl-2介导的信号转导通路可能参与了Graves病的发生、发展过程。     

幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因UreI载体的构建、融合表达及纯化

目的构建幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)尿素通道蛋白基因UreI的融合表达载体,并在E.coliBL21中表达,为进一步研究UreI的功能奠定基础。方法利用分子克隆技术以Hp DNA染色体为模板,扩增Hp UreI基因片段,将目的基因UreI与载体pET32a( )分别经kpnⅠ和HindⅢ双酶切,纯化,连接。筛选阳性重组载体,转化大肠杆菌BL21,以IPTG诱导表达pET32a( )/UreI融合蛋白。表达产物经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,用SDS-PAGE及Western blot分析。结果经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp UreI编码基因,由585 bp组成,与GenBank相应菌株HP AM417 609序列完全一致,无碱基突变。经SDS-PAGE分析显示重组质粒pET32a( )/UreI在原核细胞中得到了高效融合表达,其重组融合蛋白分子量为130 ku,经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上,Western blot分析显示,该重组融合蛋白可被6-His鼠抗单克隆抗体所识别,具有良好的反应原性。结论成功地克隆和构建了原核表达载体pET32a( )/UreI,并在原核细胞中得到了高效融合表达。     

亚洲牛带绦虫泛素缀合酶E2的克隆表达及免疫鉴定

目的 克隆表达亚洲牛带绦虫泛素缀合酶E2(UBC E2)全长编码序列,获得纯化的重组蛋白,为进一步功能研究做充分准备.方法 以亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中含有UBC E2基因的质粒作为模板,扩增该基因,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,测序鉴定重组质粒,在大肠杆菌BL-21/DE3中用IPTG诱导,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化,并使用Western blotting分析其免疫反应性.结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-28a(+)-UBC E2构建成功,该基因在大肠杆菌中以包涵体形式得到表达,十二烷基肌氨酸钠纯化后蛋白通过SDS-PAGE鉴定结果表明该基因在大肠杆菌BL-21/DE3得到高效表达,亲和层析得到高纯度的蛋白且该重组蛋白可被亚洲带绦虫及牛带绦虫患者血清识别,表明其有免疫反应性.结论 亚洲牛带绦虫UBC E2可在原核表达系统中表达,并具有免疫反应性,为进一步研究该基因的功能奠定基础.     

靶向巨噬细胞膜蛋白Vsig4特异性纳米抗体的构建和筛选

目的构建V-set and immunoglobulin domain containing 4(Vsig4)特异性纳米抗体,以期作为巨噬细胞的分子探针。方法用Vsig4重组蛋白对羊驼进行免疫,分离血液中的淋巴细胞,利用噬菌体展示技术,构建噬菌体展示文库,经过连续3次生物淘筛获得与Vsig4蛋白结合的噬菌体,经测序和基因比对所得VHH序列,用ELISA法筛选出抗Vsig4的高亲和力纳米抗体,并用Vsig4稳定表达细胞系验证纳米抗体的结合能力。结果成功构建了插入率为70%、库容量为7.27×107的噬菌体表达文库,经过克隆筛选获得136个Vsig4阳性单克隆,经测序获得15个不同的VHH基因,将这些基因克隆至原核表达体系,表达和纯化后获得了高纯度的Vsig4纳米抗体,其中Nb119的亲和力最高,并且可以与Vsig4稳定表达细胞系结合。结论成功构建并筛选了特异性、高亲和力的Vsig4纳米抗体,以期用于检测巨噬细胞表面Vsig4的表达和构建特异性分子探针。     

人B7.2(CD86)胞外区原核表达及其工程菌发酵培养的实验研究

目的　利用原核系统表达人B7.2 (IgV +C)并对工程菌发酵培养条件进行优化。方法　用聚合酶链反应 (PCR)技术从B7.2cDNA全长中克隆B7.2 (IgV +C) ,将PCR产物克隆入表达载体 pGEX 4T 3从而得到重组体 pGEX 4T 3 /hB7.2 (IgV +C) ,SDS PAGE及Westernblot用于检测目的蛋白的表达 ,同时对目的蛋白诱导表达时间及诱导剂浓度进行优化 ,对重组质粒的遗传稳定性进行鉴定。结果　Westernblot结果显示相应分子质量 5 5kD处有hB7.2 (IgV+C)与GST融合蛋白的高效表达 ,表达量占菌体总蛋白的 3 0 %左右。对工程菌进行发酵培养研究的结果表明 ,所构建的重组质粒在工程菌DH5α中传代稳定 ,未见质粒丢失 ,目的蛋白的表达不受影响 ,且在 3 7℃诱导 5h、IPTG终浓度为 4mmol·L- 1 时其表达量最多。结论　证明了利用原核系统表达人B7.2 (IgV +C)的可行性。     

幽门螺杆菌ahpC基因的克隆与原核表达

目的 构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)ahpC基因的原核表达系统,表达并纯化Ahp蛋白.方法 用PCR方法从中国分离株MEL-Hp27的染色体DNA中扩增出ahpC基因片段,将目的基因插入表达载体pET-30a中,构建重组质粒pET30a-ahpC.重组质粒经DNA测序鉴定后转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.采用镍离子亲和层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE鉴定.结果 PCR扩增的ahpC基因长度为594bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因与GenBank公布的序列相似性达99%;SDS-PAGE显示,经IPTG诱导出分子质量为23ku的目的蛋白,且产量较高.结论 成功构建了ahpC表达载体pET30a-ahpC,并在大肠杆菌中高效表达.