CNV-seq及染色体核型分析在染色体异常检测中的比较

目的探讨基因组拷贝数变异测序(copy number variation sequencing, CNV-seq)技术及染色体核型分析在染色体异常检测中的应用价值。方法采用CNV-seq技术和传统的染色体核型分析对42例患者进行染色体分析,对比分析两种检测方法的优势及局限性。结果 CNV-seq结果显示,42例标本中染色体拷贝数异常7例,检出率为16.67%;而染色体核型分析结果显示,存在8例染色体异常(其中染色体结构异常6例,数目异常2例),检出率为19.04%;此外,还检出4例为染色体多态性变异。结论 CNV-seq技术不仅能检测出常规的染色体数目和结构异常(尤其能对来源未知的染色体片段提供更为精准的检测信息),还能检测到100 kb以上的染色体片段的微缺失和微重复;CNV-seq技术不能检测染色体平衡易位和倒位等。传统的染色体核型分析联合CNV-seq检测将会为染色体异常患者提供更为精确的临床诊断。     

PCR法区别HBVRC－和CCC－DNA

乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的基因组为一松弛环状、部分双链的ＤＮＡ（ＲＣ－ＤＮＡ）。在其负链的５＇与３＇端之间存在一缺口。当ＨＢＶ进入宿主细胞后，基因组转变为共价闭合环状ＤＮＡ（ＣＣＣ－ＤＮＡ）。我们根据ＨＢＶＲＣ－和ＣＣＣ－ＤＮＡ的结构特点，设计了ＰＣＲ区别ＲＣ－和ＣＣＣ－ＤＮＡ。实验表明，该方法可有效地区别两种形式的ＨＢＶＤＮＡ。     

基于PEM的基因组结构变异检测方法

结构变异普遍存在于人类基因组中，与人类的健康和疾病息息相关，目前基因组结构变异检测方法层出不穷，其中基于双末端映射的检测方法发展尤为迅速．本文将这类主流的检测方法加以分类并进行了详细论述与分析，对更精准的基因组结构变异检测技术的研发具有指导意义．将多种检测方法有机结合共同应用于结构变异的检测，是结构变异检测技术一个未来发展趋势．     

人IL-18cDNA克隆及原核表达

目的　从外周血单核细胞中克隆人IL 1 8成熟编码序列cDNA ,对其进行测序并构建原核表达载体 ,进行原核表达。方法　从人外周血单核细胞中分离总RNA ,进行RT PCR获得人IL 1 8cDNA。测序证实其结果正确后 ,构建原核表达载体。E .coli的表达产物通过SDS PAGE、WesternBlot证实。结果　所克隆的人IL 1 8cDNA编码序列经测序证实与GenBank所报道的序列完全一致 ,细菌表达产物经SDS PAGE证实其大小约为 1 8.3KDa,WesternBlot进一步证实了所表达产物的正确性。结论　本研究结果为进一步探讨IL 1 8的生物学活性和特性奠定了基础 ,同时亦为利用人IL 1 8进行免疫基因治疗的研究打下了良好的基础。     

[Gly14]-Humanin的基因克隆及序列测定

目的利用基因工程方法对[Gly14]-Humanin进行基因克隆并测定其序列,为进一步对阿尔茨海默病进行基因治疗奠定基础。方法采用非对称互补引物/模板法,制备两端含有酶切位点的[Gly14]-Humanin的cDNA,将其克隆入pVAXI载体中并测序。结果经酶切鉴定、测序分析,表明所插入的基因片断为[Gly14]-Humanin基因,与设计完全相同。结论成功地克隆了[Gly14]-Humanin基因。     

人类OPRM1-EXON1的克隆与探针的制备

目的　克隆、测序人类 OPRM1- EXON1,并用非同位素 生物素标记法对该基因进行标记、制备探针,用于OPRM1- EXON1的表达及功能研究。方法　通过PCR法扩增目的基因片段,并将其连接到pGEM- T载体上,转入感受态细胞中进行重组并克隆,经酶切和基因测序进行鉴定,用非同位素 生物素标记法进行探针的标记与制备。结果　经过PCR扩增的目的基因片段大小(2.2 kb)与理论上片段大小一致,经过测序证实其序列与 NCBI提供的序列相同,用此片段成功的制备了用于研究阿片受体基因的探针。结论　从基因组中成功克隆了人类 OPRM1- EX ON1,并制备了探针,为深入研究吗啡依赖相关基因及基因表达创造了必要的条件。     

人GLUT4基因的克隆及原核表达的初步实验研究

目的　通过反转录聚合酶链方法 ,从人新鲜手术肌肉组织获得人葡萄糖转运子 4 (GLUT4 )cDNA基因 ,并分别克隆入测序载体、表达载体 ,获得具有正确序列的目的基因及其原核表达产物 ,为其进一步的抗体制备、活性鉴定及研究应用奠定物质基础。方法　经GenBank在线检索 ,设计、确定人GLUT4cDNA基因特异引物 ,采用反转录聚合酶链 (RT PCR)方法从一例手术的人新鲜腹部肌肉组织总RNA模板中 ,获得人GLUT4表达片段cDNA的基因 ,经克隆入测序载体pGEM 3zf(- )测序 ,验证cDNA大小、完整性及序列。再克隆入表达载体 pBV2 2 0 ,经温度诱导 ,在E .coli获得表达。结果　以设计的特异引物 ,从人肌肉组织模板中能得到预期大小完整的人GLUT4cDNA基因 ,并能插入预定的克隆载体中测序 ,所得基因的序列与目的基因的序列相符。所获GLUT4cDNA基因插入原核非融合表达载体pBV2 2 0 ,获得预期大小的重组表达产物。结论　从人肌肉组织中能获得具有正确序列、含完整起始及终止密码的人GLUT4cDNA基因。该人GLUT4cDNA基因的体外重组体能在原核表达系统表达     

影像技术应对新型冠状病毒感染肺炎的管理策略

2019年12月,武汉市发现多例不明原因肺炎患者,初期怀疑与武汉某海鲜批发市场暴露史有关,通过对病毒深度测序发现,这是一种新型的冠状病毒,世界卫生组织将其定义为2019-新型冠状病毒,简称2019-nCov。该病毒传染性极强,胸部薄层CT扫描对该病的筛查和初步诊断有非常重要作用,影像技师成为继发热门诊、感染科和ICU后最危险的一线群体。本文通过对放射科的感控难点及影像技师的工作特点进行剖析,培养无菌消毒的意识,全面体系地控制感染,提出针对放射影像技师应对2019-nCov肺炎的管理策略,旨在为所有影像同仁制定应对策略提供参考。     

SH-SY5Y细胞基因片段文库及其数据库的建立

目的　建立SH SY5Y细胞基因片段文库和一种对大量cDNA片段数据管理系统的方法。方法　采用RD PCR技术构建SH SY5Y细胞基因片段文库 ,并对每一个克隆进行测序。应用FOXPRO编制一个软件对其大量的信息进行系统化管理。结果　应用RD PCR技术建立了细胞的cDNA片段文库 ,由 12 0 0余个片段克隆组成 ;应用FOXPRO制作了基因片段数据信息管理系统的软件 ,对此文库片段的测序数据进行管理。结论　采用RD PCR技术是一个很好的建立基因片段文库的方法 ;建立了基因片段数据信息管理系统的软件进行这个文库数据的管理。     

TAT-BACEsp-GFP三融合基因慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建穿膜肽基因和BACE底物肽融合基因与绿荧光融合基因慢病毒载体,为进一步对阿尔茨海默病进行基因治疗奠定基础.方法 利用非对称互补引物/模板法制备两端含有酶切位点的TAT-BACEsp融合基因的cDNA,使之克隆到带GFP慢病毒表达载体质粒FUGW中,经限制性酶切和测序鉴定重组载体.结果 限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实获得的TAT-BACEsp产物与设计的完全吻合;TAT-BACEsp准确克隆入FUGW的多克隆位点.结论 成功构建了TAT-BACEsp与GFP 融合基因慢病毒载体,为进一步对阿尔茨海默病进行基因治疗提供了适合的稳定转染的载体.     

糖尿病性心肌病小鼠心肌线粒体circRNA表达谱与功能富集分析

目的 探索糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)小鼠心肌线粒体circRNA的差异表达情况及其功能分析。方法 以16周龄的db/db小鼠构建DCM小鼠模型,C57BL/KsJ小鼠作为对照。提取两组小鼠心肌组织RNA,高通量测序筛选两组差异表达的线粒体circRNA,使用RT-qPCR对差异表达显著的前10个circRNA验证测序结果,并对差异表达circRNA靶基因作功能富集分析,使用miRNA靶标预测软件对circRNA-miRNA共表达网络分析。结果 与对照组比较,DCM组小鼠心肌中147个差异表达的线粒体circRNA,其中高表达89个、低表达58个。差异表达circRNA在组织中的表达变化与测序结果趋势一致。GO与KEGG富集分析显示,差异表达的circRNA靶基因主要富集在cGMP/PKG、胰高血糖素等通路,与线粒体能量代谢、心肌肥大相关。circRNA-miRNA共表达网络分析发现,表达上调最显著的chrM:1207-1536+与miR-491-3p、miR-99a-3p、miR-99b-3p有关联,表达下调最显著的chrM:1453-3...     

临床致病性不动杆菌的分子生物学鉴定

目的对临床致病性不动杆菌进行种属鉴定,并比较3种方法(44℃生长试验、特异性引物PCR扩增和16SrRNA测序)对鲍曼不动杆菌鉴定的特异性、准确性及应用价值。方法收集临床致病不动杆菌56株,首先接种在胰蛋白胨大豆肉汤中44℃进行培养,观察是否可以生长;其次,提取56株不动杆菌基因组DNA,用两组不同的特异性引物进行PCR扩增鉴定;最后,用通用引物对56株不动杆菌的16SrRNA进行测序鉴定。结果 56株不动杆菌中有17株可在44℃生长。经特异性引物PCR扩增鉴定,发现8株鲍曼不动杆菌和3株13TU型不动杆菌均可在44℃中较早较快生长。金标准16SrRNA测序确定56株不动杆菌中含有9个种,其中鲍曼不动杆菌和13TU型不动杆菌的鉴定结果与特异性引物PCR扩增法相同。结论应用分子生物学方法鉴定鲍曼不动杆菌具有准确、高效且可重复性高的优点,尤其是特异性PCR扩增法,可作为较难诊断的鲍曼不动杆菌的首选鉴定方法。     

生物标志物EHD3与胃癌中免疫细胞浸润的相关性研究

目的 探讨EHD3对胃癌(STAD)患者的预后作用及其与STAD中免疫细胞浸润之间的联系。方法 利用癌症基因组图谱(TCGA)的RNA测序数据,对EHD3表达进行分析。开展差异分析、功能富集、免疫浸润、免疫检查点的探究及临床基线数据分析。采用单变量和多变量Cox回归分析识别独立预后因素,制定列线图模型并用C指数和校准图对模型进行评估。结果 EHD3在STAD中显著上调,功能富集分析表明EHD3的表达与免疫反应有关,多数免疫细胞及免疫检查点与其表达呈正相关。Cox回归结果显示,EHD3是STAD患者独立预后因素(HR=2.112,95%CI:1.340～3.327,P=0.001)。结论 EHD3可能是STAD患者的新预后生物标志物。本研究可为STAD的治疗提供一个潜在的治疗靶点。     

SD大鼠Atoh1基因CDS区的克隆及序列分析

目的利用基因工程方法克隆SD大鼠Atoh1 cDNA编码序列并测定分析其克隆序列。方法采用非对称互补引物/模板法,制备Atoh1 cDNA的编码序列,将其克隆入PMD-19T载体中并测序。结果经酶切鉴定、测序分析表明,扩增得到的大鼠Atoh1基因CDS区全长为1 056 bp,编码351个氨基酸;测定序列与GenBank中公布的参考序列对比,有2处碱基发生突变,但克隆序列编码的氨基酸序列与参考序列完全一致。这两处碱基应为单核苷酸多态性(SNP)位点,突变为无义突变,不影响蛋白的表达。结论成功克隆了Atoh1 cDNA编码序列,为进一步对感音神经性耳聋的基因治疗奠定了基础。     

SH—SY5Y细胞基因片段文库及数据库的建立

目的：建立SH-SY5Y细胞基因片段文库和一种对大量cDNA片段数据管理系统的方法。方法：采用RD-PCR技术构建SH-SY5Y细胞基因片段文库，并对每一个克隆进行测序。应用FOXPRO编制一个软件对其大量的信息进行系统化管理。结果：应用RD-PCR技术建立了细胞的cDNA片段文库，由1200余个片段克隆组成；应用FOXPRO制作了基因片段数据信息管理系统的软件，对此文库片段的测序数据进行管理。结论：采用RD-PCR技术是一个很好的建立基因片段文库的方法；建立了基因片段数据信息管理系统的软件进行这个文库数据的管理。     

幽门螺杆菌ahpC基因的克隆与原核表达

目的 构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)ahpC基因的原核表达系统,表达并纯化Ahp蛋白.方法 用PCR方法从中国分离株MEL-Hp27的染色体DNA中扩增出ahpC基因片段,将目的基因插入表达载体pET-30a中,构建重组质粒pET30a-ahpC.重组质粒经DNA测序鉴定后转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.采用镍离子亲和层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE鉴定.结果 PCR扩增的ahpC基因长度为594bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因与GenBank公布的序列相似性达99%;SDS-PAGE显示,经IPTG诱导出分子质量为23ku的目的蛋白,且产量较高.结论 成功构建了ahpC表达载体pET30a-ahpC,并在大肠杆菌中高效表达.     

miR-195表达载体构建及其对肝癌细胞株HepG2植瘤抑制效果的影响

目的研究miR-195对人肝癌细胞株HepG2肿瘤形成的影响。方法应用分子克隆技术构建miR-195表达载体;用脂质体转染以及克隆筛选技术,建立miR-195高表达HepG2细胞株,并通过测序及序列比对等进行鉴定;建立荷瘤小鼠模型,检测不同细胞系的肿瘤生长能力。结果通过测序及序列比对,证明miR-195表达载体构建成功;荧光显微镜观察结果显示,miR-195高表达HepG2细胞株成功构建,实时定量PCR鉴定结果表明,构建的miR-195高表达HepG2细胞株miR-195表达量为对照培养HepG2细胞株的2 000倍(P<0.01);植瘤实验证明,miR-195高表达可以抑制肿瘤的形成过程。结论作为抑癌的miRNA,miR-195有望成为肝癌基因治疗的效应分子。     

T细胞CTLA-4、TCRVβ8基因克隆、重组及表达

目的克隆Graves’病患者甲状腺组织T淋巴细胞的CTLA-4胞外段和TCRVβ8目的基因,重组为CTLA-4-TCRVβ8基因并表达出融合蛋白。方法RT-PCR从Graves病患者甲状腺组织中克隆T淋巴细胞的CTLA-4胞外段和TCRVβ8基因,依次与表达质粒进行连接,双酶切及测序鉴定获得正确的重组子;原核表达融合蛋白,SDS-PAGE及Western-Blotting检测蛋白表达情况。结果基因克隆扩增出CTLA-4和TCRVβ8目的基因片段,测序结果证实序列与已发表的一致。重组基因原核表达出与预期分子质量大小相符的目的蛋白。结论成功构建和表达了CT-LA-4-TCRVβ8基因,为探索Graves’病免疫耐受治疗提供了基因产品。     

基于家系的腰椎间盘突出症患者强效基因筛选策略

目的对一个椎间盘退变疾病高发家系中4名椎间盘突出患者进行外显子基因测序,寻找此家系中可能导致椎间盘退变的强效致病基因,为研究椎间盘疾病的发病原因以及致病机制提供可能的帮助。方法收集西安交通大学第一附属医院、西安医学院第一附属医院、西安唐城医院自2010年1月至2016年12月之间就诊的腰椎间盘突出患者,对其进行详细的病史采集及家系调查,从中找到椎间盘退变疾病高发的1个家系。在此家系中,20～50岁成员中有4人为腰椎间盘突出症患者。利用外显子测序技术对这4例患者进行外显子基因分析,检测4例患者的共同外显子突变位点。结果最终在4个样本中检测出IGFBP6的共同突变Chr12:g.53494591T>C。Sanger法对其进行家系内验证,IGFBP6在4例患者中皆表现为C/T型,而在5例正常对照者中皆表现为T型。最后在正常对照组200例中进行验证,未发现此位点变异。结论 IGFBP6的突变位点c.T430C(p.S144P)(Chr12:g.53494591T>C)可能是导致该家系中椎间盘突出疾病高发的因素;外显子测序技术可以应用于复杂疾病致病基因的发掘。     

中国撒拉族线粒体DNA序列遗传多态性研究

目的　以无关个体为对象 ,研究撒拉族人群线粒体DNA(mtDNA)序列遗传多态性。方法　应用PCR扩增产物直接测序法 ,对 10 0名撒拉族无关个体线粒体DNAD 环区高变区Ⅰ (HVSⅠ )进行测序分析。结果　在mtDNAHVSⅠ 16 0 91～ 16 4 18之间与Anderson相应序列比较共发现有 83处突变 ,构成 75种单倍型。点突变的主要形式为碱基替代 ,其中转换 83.5 4 % ,颠换 12 .6 6 % ,碱基插入 1.9% ,缺失 1.7%。撒拉族线粒体DNAHVSⅠ基因差异度为 0 .9912 ,偶合概率为 0 .0 189。结论　撒拉族与其他群体比较有其独特的线粒体DNA序列遗传特点 ,与亚洲其他人种及高加索人有明显差异。线粒体DNA序列多态性在群体遗传学调查及法医学个体识别方面有广泛的应用前景。