羟基红花黄色素A对MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用

目的观察羟基红花黄色素A(HSYA)对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用,并探讨其作用机制。方法采用MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率;二乙酸二氯荧光素盐(DCFH-DA)法检测细胞内活性氧(ROS)含量;罗丹明123(Rhodamine123)染色法检测细胞线粒体膜电位;Western blot法检测Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9的表达。结果 1mmol/L MPP+处理SH-SY5Y细胞48h后,细胞存活率显著降低,并诱导细胞产生凋亡,凋亡率达(38.6±1.8)%。而HSYA(15、60、120μmol/L)预处理1h,可明显增加SH-SY5Y细胞存活率(P<0.001),并能有效抑制MPP+诱导的细胞调亡(P<0.01);可明显抑制MPP+诱导的细胞内ROS的增加(P<0.001);也能有效抑制MPP+诱导的细胞线粒体膜电位的降低(P<0.01)。120μmol/L HSYA预处理能显著性增加Bcl-2/Bax比值(P<0.01);能够明显抑制MPP+诱导的胞质Cyt-C的释放(P<0.05)和Caspase-3、Caspase-9的高表达(P<0.05,P<0.05)。结论 HSYA预处理能明显提高MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤的细胞存活率,可有效抑制细胞调亡的发生,其机制可能与抑制细胞线粒体凋亡途径有关。     

线粒体途径在脱氧胆酸诱导食管黏膜上皮细胞凋亡中的作用

目的 观察线粒体途径在脱氧胆酸(deoxycholate,DCA)诱导体外培养的人正常食管黏膜上皮细胞凋亡中的作用.方法 采用无血清的角朊细胞培养基体外培养人正常食管黏膜上皮细胞,采用流式细胞仪检测Rh123和/PI的荧光强度,分析线粒体跨膜电位(△Ψm)的变化情况;蛋白免疫印迹法检测细胞色素c(Cyt.c)、Caspase-3和多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的表达及抑制剂对细胞凋亡和Caspase-3活化的影响.结果 食管黏膜上皮细胞用100μmol/L的DCA处理后,PI阴性但Rhl23低染的细胞在对照组为(1.8±0.6)%,48 h为(30.5±1.7)%;用200μmol/L的DCA处理后,PI阴性但Rh123低染的细胞36 h可达(43.1±0.2)%(P<0.05).PI阴性但Rh123低染细胞开始出现,并逐渐增加,DCA诱导细胞凋亡时线粒体跨膜电位下降,表明凋亡细胞在逐渐增多.Cyt.c和活化的Caspase-3的抗体显示,随着线粒体△Ψm的下降,Cyt.c、Caspase-3酶原也被剪切活化,Casapse-3的底物PARP也发生了降解活化.Caspase-3特异性抑制剂DEVD-FMK部分抑制了DCA诱导食管上皮细胞的凋亡,但对线粒体跨膜电位的下降则没有影响.结论 DCA诱导食管黏膜上皮细胞凋亡是通过线粒体途径引起的,线粒体、Caspase-3、PARP的活化共同参与了DCA诱导食管黏膜上皮的凋亡过程.     

藏红花素抑制谷氨酸盐诱导的视网膜神经节细胞凋亡

目的研究藏红花素通过影响Ca~(2+)内流对谷氨酸盐诱导的视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡的影响及可能机制。方法分离大鼠RGCs,以0.1、1mmol/L的谷氨酸盐刺激RGCs 24、48h,建立RGCs凋亡模型,并用0.1、1.0、3.0μmol/L浓度梯度藏红花素分别处理。Annexin V-FITC/PI双标检测细胞凋亡率,Fluo-3/AM荧光标记Ca~(2+)检测胞内钙离子浓度,Western blot检测藏红花素对胞内钙离子介导的凋亡信号分子calpain和CaMKⅡ表达的影响。JC-1荧光染色和Western blot分别检测藏红花素对线粒体膜电位和线粒体凋亡相关信号分子Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2/Bax表达的影响。结果 0.1mmol/L谷氨酸盐刺激24h,RGCs细胞凋亡率与对照组差异无统计学意义(P>0.05);而当刺激48h时,RGCs的凋亡率达到(43.050±2.616)%,差异有统计学意义(P<0.01)。高剂量谷氨酸盐(1mmol/L)刺激24、48h的RGCs凋亡率为(46.450±1.061)%和(45.500±3.253)%,较对照组均显著增加,差异有统计学意义(P<0.01)。用1mmol/L谷氨酸盐刺激RGCs 12h后加入0.1、1.0、3.0μmol/L藏红花素再处理12h,不同浓度藏红花素均可显著抑制细胞凋亡(P<0.01),且抑制效率具有剂量依赖性。另外,1.0μmol/L藏红花素组的谷氨酸盐诱导的胞外Ca~(2+)内流减少及钙依赖蛋白Calpain1和CaMKⅡ的表达减弱,线粒体膜电位增高,Caspase-3和Caspase-9的表达减少,Bcl-2/Bax表达上调。结论藏红花素抑制谷氨酸盐诱导的RGCs凋亡,其机制可能与阻止胞外Ca~(2+)内流,抑制钙依赖的凋亡信号通路和线粒体凋亡信号通路有关。     

抗氧化剂对过氧化氢处理的急性单核细胞白血病细胞增殖的影响

目的通过建立急性单核细胞白血病活性氧(ROS)细胞模型,观察抗氧化剂对其增殖的影响。方法选用人单核细胞白血病U937细胞株,用不同浓度过氧化氢(H_2O_2)处理,成功建立ROS细胞模型后给予不同浓度抗氧化剂超氧化物歧化酶(SOD)处理,检测细胞增殖、细胞内ROS含量、线粒体膜电位的变化。结果低浓度H2O2(50μmol/L)刺激U937细胞增殖;高浓度H_2O_2(500μmol/L)对U937细胞产生毒性作用。以50μmol/L H_2O_2处理U937细胞48h建立实验模型。正常U937细胞内存在少量ROS,少量凋亡细胞;50μmol/L H_2O_2处理后细胞内ROS增多,线粒体膜电位升高,凋亡率下降,细胞增殖旺盛,新合成的DNA增多;加入不同浓度抗氧化剂SOD,随着SOD浓度升高,ROS含量减少,线粒体膜电位下降,凋亡率增加,细胞增殖减慢,新合成的DNA减少,表现出剂量依赖性。结论抗氧化剂对急性单核细胞白血病细胞增殖有抑制作用,且表现剂量依赖性。     

葛根素对过氧化氢诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用

目的探讨葛根素对过氧化氢诱导人血管内皮细胞(HUVECs)损伤的保护作用及其机制。方法培养HUVECs并分组:正常组(不加任何干预因素);过氧化氢组(在细胞培养体系中加入终浓度为0.5mmol/L过氧化氢);葛根素25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L组(先分别加入相应质量浓度葛根素干预30min后,再加入过氧化氢)。各组培养24h后,通过MTT法检测细胞增殖能力;检测纤溶酶原激活物(t-PA)及纤溶酶原激活剂抑制物(PAI)活性观察HUVECs功能;取培养上清液测定超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)的含量;采用Annexin V/PI染色后,应用流式细胞仪检测HUVECs凋亡率,并检测caspase-3表达水平与线粒体膜电位变化。结果与正常组比较,过氧化氢可明显降低HUVECs增殖活性(P<0.01),t-PA活性下降及PAI活性增加;而预防应用不同浓度葛根素能够不同程度对抗其作用,且最佳保护浓度是100mg/L。与过氧化氢组比较,葛根素能够显著降低HUVECs的MDA水平、细胞凋亡率、caspase-3阳性率及线粒体损伤率,能够显著提高HUVECs的SOD水平(P<0.05)。结论葛根素对氧化应激诱导HUVECs损伤具有一定的保护作用,其机制可能与其抗氧化、维持线粒体膜电位、减低caspase-3表达而抑制细胞凋亡有关。     

TGF-β2诱导晶状体上皮细胞凋亡的机制

目的探讨晶状体后囊膜混浊(posterior capsular opacification,PCO)过程中转化生长因子-β2(transforming growth factorβ2,TGF-β2)诱导晶状体上皮细胞(human lens epithelial cell,HLEC)凋亡的机制。方法用不同浓度TGF-β2(0、0.1、1、10μg/L)处理HLEC后,Western blot检测TGF-β2诱导的线粒体途径依赖的细胞凋亡相关蛋白表达;流式细胞仪检测5μg/L TGF-β2诱导细胞凋亡的具体形式,以及5μg/L TGF-β2处理细胞36h对细胞周期的影响。结果 TGF-β2可明显增加Caspase3的表达(P<0.001),促凋亡蛋白Bax与抑凋亡蛋白Bcl-2的表达比例失调(P<0.001)并呈浓度依赖性,激活内源性线粒体途径的Bax/Bcl-2-caspase3通路的凋亡。5μg/L的TGF-β2可以诱导HLEC发生凋亡(P<0.05),处理细胞36h后可导致G1/S周期阻滞。结论 PCO过程中伴随TGF-β2诱导的线粒体途经的细胞凋亡,可能参与了PCO的形成过程,将为PCO发病机理及药物开发提供新思路。     

芹菜素通过抑制NF-κB信号通路缓解高糖对雪旺细胞的损伤

目的研究芹菜素对高糖培养条件下雪旺细胞损伤的保护作用,为芹菜素治疗糖尿病周围神经损伤提供初步的实验依据。方法体外培养RSC96雪旺细胞,分为对照组(葡萄糖浓度为5.6 mmol/L)、高糖组(培养液葡萄糖浓度为50 mmol/L)和芹菜素组(在高糖基础上加入0.1、1.0、10.0μmol/L芹菜素)。CCK-8法检测细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA法检测神经生长因子(NGF)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达;Western blot检测细胞中Bcl-2、Bax、NF-κB、p-NF-κB的表达。qRT-PCR检测细胞中Bcl-2和Bax的mRNA表达。结果与高糖组比较,低浓度的芹菜素(≤1.0μmol/L)提高细胞活性(P<0.05),并存在浓度依赖性;10.0μmol/L芹菜素对细胞增殖则没有明显作用。1.0μmol/L芹菜素显著抑制高糖培养条件下细胞凋亡(P<0.05)。同时,芹菜素显著增加高糖培养条件下细胞中Bcl-2蛋白和mRNA表达,但抑制Bax基因蛋白和mRNA表达。与高糖组比较,1.0μmol/L芹菜素显著增加NGF表达,并抑制TNF-α表达(P<0.05)。此外,芹菜素可显著抑制高糖培养条件下NF-κB磷酸化水平(P<0.05)。结论芹菜素增加高糖诱导的雪旺细胞活性,抑制细胞凋亡并调节NGF和TNF-α表达,该机制可能与抑制NF-κB信号通路有关。     

H_2O_2诱导SD大鼠视网膜细胞凋亡过程中细胞内钙离子浓度的变化

目的观察H2O2诱导原代培养SD大鼠视网膜细胞凋亡过程中细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的变化及其来源。方法取1~3d内新生SD大鼠视网膜进行原代细胞培养,以100μmol/L H2O2作用0、2、4、8、12、24h,采用MTT法进行细胞活力检测,应用Hoechst 33342染色法进行细胞凋亡检测,以Fluo-3AM为细胞内Ca2+探针并利用荧光激活细胞分类技术(FACS)进行[Ca2+]i检测,确定H2O2诱导细胞损伤及凋亡过程中[Ca2+]i的变化;应用细胞外Ca2+螯合剂EGTA初步检测H2O2诱导的[Ca2+]i变化是否源于细胞外Ca2+内流。结果 100μmol/L H2O2可诱导原代培养的SD大鼠视网膜细胞发生凋亡,且凋亡数目呈时间依赖性递增;100μmol/L H2O2作用2~24h均可显著降低细胞活力,而[Ca2+]i的升高出现在H2O2作用2h且维持至12h,然后逐渐下降,至24h恢复至正常水平;0.5~5mmol/L EGTA可显著削弱由100μmol/L H2O2作用2h导致的[Ca2+]i增加。结论在H2O2诱导原代培养的SD大鼠视网膜细胞发生凋亡过程中,[Ca2+]i的升高发生在凋亡的早期阶段,而非细胞凋亡全过程中;H2O2的损伤作用所导致的[Ca2+]i升高部分来源于细胞外Ca2+的内流。     

应用流式细胞术检测17β-雌二醇对H2O2诱导的视网膜神经细胞凋亡的保护作用

目的用流式细胞技术(FACS)检测H2O2诱导的视网膜神经细胞凋亡以及17β-雌二醇(βE2)对细胞的保护作用。方法取新生24 h内的SD大鼠进行视网膜神经细胞的原代培养,待细胞培养4-5 d,经不同因素处理后,用MTT法检测细胞存活率,用FACS法检测细胞凋亡率。结果200μmol/L的H2O2能有效诱导视网膜神经细胞凋亡;低浓度的H2O2不能诱导细胞凋亡,但高浓度的H2O2诱导细胞凋亡的同时也导致了正常细胞比率的锐减;10μmol/L的βE2能有效对抗H2O2诱导的视网膜神经细胞凋亡;低浓度的βE2对细胞未表现出保护作用,高浓度的βE2对细胞反而表现出毒性作用。结论一定浓度的βE2在一定范围内能对抗H2O2诱导的视网膜神经细胞凋亡,表现对神经细胞保护的作用。     

甘氨脱氧胆酸盐诱导人正常肝细胞HL-7702凋亡及其机制的研究

目的 观察甘氨脱氧胆酸盐(glycodeoxycholate, GCDC)对人正常肝细胞株HL-7702凋亡的影响,并探讨其凋亡机制.方法 终浓度分别为100、150、200、250μmol/L的GCDC处理HL-7702细胞24h,光学显微镜观察GCDC对HL-7702细胞形态的影响,AnnexinV-FITC/PI双染色法检测HL-7702细胞的凋亡率 ,用荧光指示剂Fluo-3/AM测定HL-7702细胞内钙离子浓度,RT-PCR测定Bcl-2、Bax基因mRNA表达水平.结果 终浓度为150μmol/L的GCDC处理HL-7702细胞24h后,细胞出现典型的凋亡细胞形态学改变;100、150、200、250μmol/L的GCDC均可诱导HL-7702细胞凋亡,呈剂量依赖性,凋亡率分别为(13.16±2.9)% (t=6.41)、(20.3±3.0)% (t=10.22)、(25.02±2.1)% (t=18.11)、(45.02±3.5)% (t=28.89),较对照组(2.2±0.6)%显著升高(P＜0.05);GCDC能使HL-7702细胞内钙离子浓度增加,且具有浓度依赖性;GCDC使细胞内Bcl-2 mRNA的表达下降、Bax mRNA的表达增加.结论 GCDC可能是通过增加HL-7702细胞内钙离子浓度,并进一步下调Bcl-2、上调Bax表达水平,从而诱导细胞凋亡.     

STUDY ON DIFFERENTIATION OF RATS EMBRYONIC STEM CELLS CULTURED IN BRL-CM INTO NEURAL PRECURSOR CELLS

Embryonicstem (ES)cellsrefertothosesepa ratedfromtheinteriorcellmassthathasnotyetim bedded .Thesetotipotentialcellsareinhighundif ferentiatedstate ,canbecultivatedandproliferateinvitro[1] .Underinductioninvitro ,EScellscanbedifferentiatedintocellsthatbelongtothreeembry oniclayers[2 ] ,suchasmyocardiumcells ,bloodcellsandneuralcells .GeneticoperationscanbedonewithoutlosingfeaturesoftheEScells.Thereforeithasbecomethemaintoolintheup to datedcelltherapy .Becausetheyarelikelytoformteratomawhentr…     

新型光伏锂电无均衡管理储能发电系统

提出了一种新型光伏锂电储能系统拓扑结构.在该结构中,光伏电池与锂离子电池单体之间通过控制单元实现能量耦合,通过光伏电池与锂离子电池单体之间的结构耦合,实现锂离子电池的无均衡管理（NBCM）.对该拓扑结构进行了仿真和实验验证,实验结果表明,该光伏锂电储能模组能够在以欠压浮充为投切判据的控制单元工作模式下,实现光伏电池近似MPPT工作的同时,能有效地对锂离子电池进行充放电;与肖特基二极管近似直连相比,通过MOSFET以近似直连的方式耦合选定工作电压的30 W光伏电池与锂离子电池能够提升模组能量效率约8%,在独立运行和并网运行光伏储能发电系统中均可应用.      

同一膀胱癌的三个亚细胞株和BIU-87膀胱癌细胞株的化疗药物敏感性研究

用未经化疗的同一膀胱癌手术标本建立的三株膀胱癌细胞株 (BL Z2 11、BL S2 11、BL X2 11)和人膀胱移行细胞癌细胞株 BIU- 87进行了氟尿啶啶 (5- Fu)、顺氯氨铂 (CDDP)、和长春新碱 (VCR)的敏感性试验。结果表明 :四株膀胱癌细胞株对这三种化疗药物的敏感性存在差异。当药物浓度分别为其临床用量的计算值时 ,BL Z2 11细胞株对 5- Fu高度敏感 ,与其它三株细胞的敏感性存在显著差异(P <0 .0 5) ;四株细胞对 CDDP均敏感 ;对 VCR四株细胞均耐药。提示 :对化疗敏感性的差异不仅存在于不同的肿瘤病人 ,而且也存在同一肿瘤标本的不同细胞群体中。因此 ,化疗前进行药敏试验 ,实行用药个体化对提高疗效有重要作用。     

顺铂作用于人肝癌细胞系HepG2后肿瘤干细胞标志物增加

目的探讨顺铂(cisplatin)作用于人肝癌细胞系HepG2后细胞增殖能力和周期的变化,及残余细胞中CD133、ABCG2及ICAM-1表达量的变化。方法以人肝癌细胞系HepG2为研究对象,分别采用MTT比色法和PI染色法检测不同浓度cisplatin作用后细胞增殖能力及细胞周期分布的变化;免疫荧光法检测cisplatin对肿瘤干细胞标志物表达量的影响。结果不同浓度cisplatin作用后均可明显抑制HepG2细胞的增殖。进一步研究发现,分别使用4mg/L和2mg/L的cisplatin作用48h后对HepG2细胞周期G0/G1期及S期有显著影响,cisplatin处理使残留HepG2细胞中CD133、ABCG2及ICAM-1的表达量明显升高。结论 HepG2细胞中存在的小部分肝癌干细胞能够逃脱cisplatin的杀伤作用,此种逃避过程的发生可能是临床上肝癌经治疗后复发的重要原因。     

miR-1246对人宫颈癌SiHa细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响及其靶基因的初步研究

目的探讨miR-1246对人宫颈癌SiHa细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响。方法将SiHa细胞分成3组,分别转染miR-1246mimics(模拟物)、miR-1246inhibitor(抑制物)、空白质粒,并测定转染效率。采用MTT法对比转染后SiHa细胞增殖能力的区别;Transwell小室、划痕实验对比转染后SiHa细胞侵袭、迁移能力的区别;Western blot对比转染后SiHa细胞表达THBS2(血小板反应蛋白2)的区别。构建THBS2的3UTR双荧光素酶质粒,与miR-1246共转染入SiHa细胞,检测荧光素酶的相对活性。结果转染miR-1246mimics的SiHa细胞,MTT试验显示其增殖能力较另外两组强;划痕实验显示细胞的迁移能力较另两组强;迁移、侵袭实验显示该组细胞穿膜数量较另外两组多(P<0.01);WB实验显示其THBS2蛋白低表达(灰度值6.28±10.22,与空白对照组相比P=0.013)。转染miR-1246inhibitor的SiHa细胞,MTT试验显示其生长速度较另外两组慢;划痕实验显示细胞的迁移能力较另两组弱;迁移、侵袭实验显示该组细胞穿膜数量较另外两组少(P<0.01);WB实验显示其THBS2蛋白表达稍高(灰度值12.90±19.81,与空白对照组相比P=0.037)。共转染miR-1246mimics和包含THBS2的3UTR端双萤光素酶质粒后,SiHa细胞荧光素酶表达降低。结论 miR-1246对人宫颈癌SiHa细胞的增殖、侵袭、迁移能力有促进作用,THBS2是其靶基因,降调靶蛋白THBS2的表达,可能是miR-1246促进宫颈癌发生发展的其中一个机制。     

14周至足月胎儿角膜上皮干细胞的分布及超微结构观察

目的观察胚胎期角膜上皮干细胞的迁移规律及其超微结构,为利用胎儿角膜上皮干细胞提供理论依据。方法观察14至38周胎儿角膜上皮HE及抗人64ku角蛋白单克隆抗体(mAE5)染色反应,并观察胎儿角膜上皮干细胞的超微结构。结果14周角膜上皮由一层基底细胞被覆一至两层鳞状细胞构成,且仅有表层鳞状细胞mAE5弱阳性反应。17至29周缘部上皮有3~5层,中央部有2~3层,整层基底细胞mAE5反应阴性,其上鳞状细胞呈强阳性。33至38周角膜上皮已近成熟,仅剩缘部基底上皮细胞mAE5反应阴性。超微结构显示mAE5阴性反应的基底层细胞核异染色质多,胞质中细胞器较少,且细胞间连接也较少。结论胎儿角膜上皮干细胞呈现由全层向基底层,再向缘部逐渐迁移的分布规律,且超微结构较幼稚。     

人晶状体上皮细胞原代培养方法的改进

目的 建立一种简单有效的人晶状体上皮细胞体外培养的方法.方法 用组织块培养法,采用连续花瓣状撕囊法获得人白内障患者的晶状体前囊膜,使用含有表皮生长因子的培养液进行培养,对培养的细胞进行形态学观察及鉴定;在倒置相差显微镜下观察其生长规律,应用免疫荧光组织化学法进行鉴定.结果 体外培养的原代人晶状体上皮细胞在组织块贴壁24 h后从组织块边缘长出,具有上皮细胞的形态特点.αA-晶状体蛋白抗体阳性率几乎100％,鉴定为晶状体上皮细胞.结论 采用连续花瓣状撕囊法获得的组织块较易在体外培养出入晶状体上皮细胞,可用于白内障后囊膜混浊发病机制的进一步研究.     

小鼠胚胎肠神经嵴干细胞的分离培养及鉴定

目的建立分离培养及鉴定小鼠肠神经嵴干细胞(gut neural crest stem cells,GNCSCs)的方法,为临床应用奠定基础。方法分离胚鼠肠管,消化后接种于添加N2、B27和碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基,贴壁培养;连续传代后用血清促进GNCSCs分化;最后用免疫细胞化学方法染色鉴定。结果分离培养的细胞聚集生长,形成的克隆球可以传代;克隆球p75染色阳性;分化后的细胞分别表达肠神经元、神经胶质细胞和平滑肌细胞特异性抗原。结论分离培养的克隆球具有自我更新和多向分化的能力,表达肠神经嵴干细胞的特异性抗原p75,是肠神经嵴干细胞。     

肝癌细胞的融合方法探讨

本实验用离心和静止两种方法及分子量分别为6000和1000的PEG时培养的肝癌细胞进行融合,发现用离心法和分子量为1000的50%PEG进行融合时其融合率最高。作者还对细胞融合过程进行了观察,发现细胞在开始融合的1.5h时细胞质已经融合;在2.5h时细胞核开始融合。     

三株新建人膀胱癌细胞系染色体畸变特点

应用G-显带技术对来源于同一膀胱癌手术标本的三株新建的克隆性膀胱癌细胞系（BLZ211，BLX211和BLS211）的核型进行分析，发现所有的核型均为超二倍体，染色体众数分别是63、62和69；每个细胞都缺失一条9号染色体，7号染色体多为三条或四条；每个细胞系都有五个固定出现的异常染色体，其中四条是三个细胞系共有的：①4号染色体的结构重排，4pter→4q35：：？，②9号染色体臂间倒位，inv（9）（p21q22），③2个不能识别的标记染色体．M3和M4。本文研究结果表明9号和7号染色体改变是这三株人膀胱癌细胞的原发染色体畸变。