人B7.2(CD86)胞外区原核表达及其工程菌发酵培养的实验研究

目的　利用原核系统表达人B7.2 (IgV +C)并对工程菌发酵培养条件进行优化。方法　用聚合酶链反应 (PCR)技术从B7.2cDNA全长中克隆B7.2 (IgV +C) ,将PCR产物克隆入表达载体 pGEX 4T 3从而得到重组体 pGEX 4T 3 /hB7.2 (IgV +C) ,SDS PAGE及Westernblot用于检测目的蛋白的表达 ,同时对目的蛋白诱导表达时间及诱导剂浓度进行优化 ,对重组质粒的遗传稳定性进行鉴定。结果　Westernblot结果显示相应分子质量 5 5kD处有hB7.2 (IgV+C)与GST融合蛋白的高效表达 ,表达量占菌体总蛋白的 3 0 %左右。对工程菌进行发酵培养研究的结果表明 ,所构建的重组质粒在工程菌DH5α中传代稳定 ,未见质粒丢失 ,目的蛋白的表达不受影响 ,且在 3 7℃诱导 5h、IPTG终浓度为 4mmol·L- 1 时其表达量最多。结论　证明了利用原核系统表达人B7.2 (IgV +C)的可行性。     

人白介素24cDNA克隆、突变纠正和原核表达

目的获取人白介素24(IL-24)cDNA,构建原核表达载体以表达含有谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白GST-IL-24。方法以人外周血单核细胞(PBMC)总RNA为模板,RT-PCR扩增IL-24 cDNA,克隆入原核表达载体pGEX-4T-2,测序结果显示在IL-24 cDNA第223位G→A,370位T→C,从而导致其编码蛋白的氨基酸发生改变:A75T,H124Y,通过二次PCR将其纠正,重组载体pGEX-IL-24转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基--βD-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE,Western blot检测显示有融合蛋白GST-IL-24表达。结果通过RT-PCR及二次PCR得到人IL-24 cDNA,构建其原核表达载体,经IPTG诱导在相对分子量约为50 000处有融合蛋白表达。结论IL-24的重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)可以表达GST-IL-24融合蛋白。     

B7.1胞外编码区的真核表达及其生物活性

目的　真核表达B7.1细胞外编码区以研究其生物学活性。方法　电穿孔法将重组质粒pDisplay/B7.1(V +C)导入人子宫颈癌细胞株 ,免疫组化及核酸原位杂交法分别检测其蛋白及mRNA表达 ,3 H TdR掺入法测定表达物对T细胞的刺激作用 ;MTT法研究转染细胞 T细胞混合培养引发的细胞毒性杀伤作用。结果　B7.1细胞外区在Hela细胞表面表达 ,所表达的B7.1细胞外区在抗CD3单抗存在的情况下具有刺激T细胞活化的特性 ,重组质粒转染的Hela细胞与T细胞混合培养可引起细胞毒性杀伤。结论　真核表达的B7.1(V +C)具有T细胞共刺激活性 ,可用于构建肿瘤免疫治疗之双功能分子。     

抗人γ-精浆蛋白V_H单域抗体基因的构建、表达及空间构象分析

目的　扩增出抗人γ 精浆蛋白 (γ Sm)单克隆抗体 (mAb)的重链可变区 (VH)单域抗体基因 ,并进行原核表达及空间构象分析。方法　从分泌抗γ SmmAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA ,经RT PCR扩增VH 单域抗体基因 ,将其克隆到融合蛋白表达载体 pGEX 4T 1中进行表达 ,并利用计算机软件对表达产物进行空间构象分析。结果　VH 单域抗体基因全长 363bp ,含起始码和终止码。将其克隆到 pGEX 4T 1内 ,转化大肠杆菌DH5α ,获得高效表达 ,表达量占全菌总蛋白质的 38% ,以包涵体形式存在。经初步纯化和复性后 ,用谷胱甘肽 (GST)亲和色谱纯化 ,再经凝血酶水解获得抗γ SmVH 单域抗体。竞争结合抑制实验证明 ,该表达产物具有前列腺癌细胞亲和活性。空间构象分析结果显示 ,该抗体具有完整的抗原结合位点。结论　构建成功抗γ Sm的VH 单域抗体 ,为进一步临床应用奠定基础。     

饰胶蛋白(Decorin)基因的cDNA克隆与表达

目的　通过基因克隆技术获得饰胶蛋白基因cDNA克隆并表达。为研究饰胶蛋白的生物学功能及应用打基础。方法　应用PCR技术从T细胞cDNA文库获得饰胶蛋白全长基因cDNA片段 ,并克隆到pUC1 9载体中 ,采用Sanger双脱氧末端终止法测定全部cDNA序列 ,将测序正确的饰胶蛋白cDNA序列插入pGEX 4T 1表达载体中 ,经BamHI和EcoRI双酶切后 1 2 %凝胶电泳鉴定 ,IPTG诱导表达产物经SDS PAGE分析。结果　克隆的饰胶蛋白cDNA序列与GenBank中AF1 3830 0记载的序列完全一致 ,所表达的融合蛋白质分子量与理论计算值(65 6KD)也一致并为可溶性蛋白。结论　本研究成功地克隆了饰胶蛋白基因和表达了GST Decorin融合蛋白     

重组人单链白细胞介素12融合基因(rhscIL-12)的构建和真核表达

克隆人 IL - 1 2 ( h IL - 1 2 ) p40和 p35亚单位 c DNA,构建人单链 IL- 1 2 ( rhsc IL- 1 2 )融合基因 ,并在哺乳动物细胞中进行表达。方法　从经 PDBu刺激的 EBV转化的人 B淋巴母细胞株 NC37中提取 m RNA,经 RT- PCR分别获得 h IL- 1 2 p40和 p35亚单位编码序列的 c DNA,运用重组 PCR技术将两段基因通过一疏水性多肽接头 ( Gly4 Ser) 3 DNA序列进行体外基因重组 ,构建 rhsc IL- 1 2融合基因 ,将其插入 pc DNA3.1 ( + )真核表达载体 ,经脂质体转染 COS7细胞进行表达 ,Western blot进行分析。结果　所克隆的 h IL- 1 2 p40、p35c DNA序列和构建的 rhsc IL - 1 2融合基因 DNA序列均经测序得以证实 ,融合基因可在 COS7中表达其产物 rhsc IL- 1 2融合蛋白 ,其分子量为 70 KD,可与鼠抗人 IL - 1 2 p40 /p70单克隆抗体特异性结合。结论　本研究结果为进一步探讨 rhsc IL- 1 2融合蛋白的生物学活性和特性奠定了基础 ,也为 rhsc IL- 1 2融合基因在原核细胞中的表达提供了可能性     

STUDY ON B7-1 PROTEIN‘S EXPRESSION IN BIOPSIES IN RENAL TRANSPLANTATION

Ａｌｌｏｇｒａｆｔｒｅｊｅｃｔｉｏｎｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｆａｃｔｏｒｏｆｉｎ ｆｌｕｅｎｃｉｎｇｔｈｅｌｏｎｇｔｅｒｍｓｕｒｖｉｖａｌｏｆａｌｌｏｇｒａｆｔｉｎｈｕ ｍａｎｏｒｇａｎｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ .Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｉｓａｍａｉｎ ｐａｒｔｉｎｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｏｒｇａｎｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ .Ｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｒｅｊｅｃｔｉｏｎａｎｄｓｅｅｋ…     

小鼠抗人T淋巴细胞表面抗原噬菌体抗体库的构建及筛选

目的　构建并筛选小鼠抗人静息 /活化T淋巴细胞表面抗原的噬菌体展示抗体库。方法　以人静息 /活化T淋巴细胞免疫Balb/c小鼠 ,取脾细胞 ,RT -PCR扩增VH 和VK 基因 ,拼接为ScFv ,插入噬菌粒载体转化大肠杆菌 ,构建了噬菌体展示抗体库 ,以人T淋巴细胞为靶抗原 ,对该库进行了 3轮淘洗 ,ELISA方法鉴定噬菌体抗体。结果　成功构建了最大实际库容量为 1 .75× 1 0 6的小鼠抗人静息T淋巴细胞表面抗原的噬菌体展示ScFv抗体库和小鼠抗人活化T淋巴细胞表面抗原的噬菌体展示ScFv抗体库。结论　所构建的抗体库可进一步用于对T淋巴细胞表面蛋白抗原的差异显示分析及构建基因工程抗体。     

人颗粒酶B融合蛋白基因的诱导表达导致HeLa细胞凋亡

目的　观察诱导表达的颗粒酶B融合蛋白对HeLa细胞形态和生长的作用。方法　用重组PCR法将活性型颗粒酶B基因序列的 5’端连接绿脓杆菌外毒素 (PE)的部分转位肽编码序列。所获融合蛋白基因克隆入pIND诱导表达载体后 ,与辅助质粒pVgRXR共转染HeLa细胞 ,经G4 18和zeocin筛选建系。间接免疫荧光检测蜕皮激素诱导后目的蛋白的表达 ,并通过电镜、TUNEL染色、细胞计数等方法观察细胞的形态和生长速度的变化。结果　建立了可诱导表达人颗粒酶B融合蛋白基因的HeLa细胞系。蜕皮激素诱导后检测到目的蛋白的表达 ,同时观察到细胞出现多核巨细胞的异常形态 ,细胞生长受到抑制。电镜和TUNEL分析表明 ,颗粒酶B融合蛋白基因的诱导表达使部分细胞呈现凋亡的典型特征。结论　颗粒酶B融合蛋白基因的诱导表达导致HeLa细胞凋亡     

THE CLONING OF HUMAN NEUROTROPHIN-3 GENE

Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－３（ＮＴ－３）ｉｓａｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｆａｍｉｌｙｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｙｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ〔１〕．Ｔｈｅｇｅｎｅｏｆｈｕｍａｎｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－３（ｈＮＴ－３）ｉｓｌｏｃａ...     

Anti-CD3 scFv-B7.1真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的初步表达

目的　构建anti CD3scFv B7.1真核表达载体 ,并进行初步表达。方法　采用重叠延伸拼接法 (splicingbyoverlapextention ,SOE)将anti CD3scFv和B7.1(V +C)两个基因片段通过spacer序列连接 ,将融合基因克隆入T载体 ,并测序证实。在此基础上构建真核表达载体pcDNA/anti CD3scFv B7.1,并经脂质体法转染COS 7细胞 ,免疫组织化学法检测表达。结果　获得了序列与预期完全相同的融合基因 ;构建了抗CD3scFv B7.1融合基因真核表达载体 ;在COS 7细胞中获得初步表达。结论　成功构建及表达抗CD3scFv B7.1融合基因真核表达载体 ,为进一步研究抗CD3scFv B7.1双功能分子的生物学活性及用于肿瘤生物治疗奠定了基础     

丙型肝炎病毒NS3-NS4基因的表达及鉴定

目的　构建丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS3 NS4全长基因重组质粒并诱导表达 ,鉴定NS3 NS4蛋白的抗原性。方法　应用PCR技术从pUC19/HCV中扩增目的基因 ,构建重组表达质粒 ,进行原核表达 ,用SDS PAGE、ELISA技术对表达产物的抗原性进行鉴定。结果　成功构建、表达了重组质粒pBV2 2 0 /NS3 NS4 ,用 5 0份质控标准血清对表达蛋白质进行抗原性检测 ,与第二代诊断试剂相比 ,总符合率为 96 %。结论　全长NS3 NS4蛋白是一个优势免疫原性区 ,应该是HCVEIA诊断试剂的有效成分。     

人杀菌渗透增强性蛋白N末端片段在大肠杆菌中的表达

目的构建表达人杀菌渗透增强性蛋白(BPI)N-端193个氨基酸的重组表达质粒,诱导表达BPI193重组蛋白。方法应用RT-PCR的方法从HL-60细胞内扩增出BPI氨基端1-193个氨基酸的基因序列,克隆入T载体。将BPI193基因片段定向克隆入原核表达载体PET-28a中,构建重组的原核表达质粒PET-BPI193,转化大肠杆菌BL21菌株,用IPTG诱导表达蛋白。应用SDS-PAGE检测蛋白表达情况,计算机薄层扫描分析蛋白占菌体总蛋白百分比;Western-blot技术检测表达蛋白的特异性。结果从HL-60细胞中扩增得到579bp的BPI193基因片段,构建了T-BPI193亚克隆和PET-BPI193重组表达质粒。转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导,经SDS-PAGE检测表明,成功表达了6His-BPI193融合蛋白。计算机薄层扫描分析表达量占菌体总蛋白的12%。Western-blot检测显示表达产物具有特异性。结论成功构建了PET-BPI193重组表达质粒。在大肠杆菌BL21内,诱导获得了BPI193与组氨酸融合表达的重组蛋白。     

人B7.2 cDNA的克隆及其真核表达

为克隆人 B7.2 c DNA,构建 B7.2真核表达质粒 ,并在哺乳动物细胞中表达。分离正常人淋巴结淋巴细胞 ,经 LPS诱导后 ,以 RT- PCR,克隆 B7.2 c DNA;构建真核表达质粒 p BCMGSNeo- B7.2 ,转染哺乳细胞 ,进行表达。结果成功克隆了 B7.2c DNA,并经测序证实 :所构建的 B7.2抗原真核表达质粒可在哺乳动物细胞中高效表达。表明经 LPS诱导的人淋巴细胞可表达 B7.2 m RNA,所建立的 p BCMGSNeo-B7.2哺乳动物真核表达质粒 ,可供进一步研究 B7.2结构和功能。     

ROLE OF ANTISENSE AND DECOY OLIGONUCLEOTIDE OF NF-κB IN VESSEL STENOSIS AND NEOINTIMA FORMATION IN BALLOON-INJURED RAT ARTERY

Objective To examine antisense and decoy oligonucleotides of nuclear factor kappa B in vivo effects on intima proliferation and balloon-injured monocytes chemotactic protein-1 ( MCP-1 ) and extracellular signal regulated kinase-2 ( ERK2 ) expression in the carotid artery of rats. Methods Sprague-Dawley rats underwent balloon-dilation injury of the left carotid artery. Rats are divided into 7 groups ( n = 18 ) and each group includes 6 time points (6 h, 1, 3, 5, 7, 14 d) ( n =3). Uninjured right carotid artery of the same rat was used as controls. Results In model group, sense group and scramble group, vessel intima area , media area and intima/media ratio increased after 5 d and reached the maximum after 7 d. The effect of antisense plus decoy group on intimal hyperplasia was more obvious than that of antisense group and decoy group alone. MCP-1 mRNA expression was increased expression continuously at 3, 5 and 7 d and decreased at 14 d. Compared with model group, sense group and scramble group, antisense group, decoy group and antisense plus decoy group had lowered MCP-1 mRNA expression in each time point ( P ＜ 0. 05 ). NF-κB p65 was dispersed positive stain 6 h after injury and increased after 1 d and peaked at 7 d, but the protein expression was weak at 14 d. ERK2 protein synthesis increased at 1 d and reached the peak at 7 d, while protein expression after 14 d was similar to that at 7 d. Treatment of antisense group,decoy group and antisense plus decoy group inhibited protein synthesis more significantly than those of model group,sense group and scramble group ( P ＜ 0. 05 ). Conclusion NF-κB modulates genes expression and protein synthesis of MCP-1 and ERK2. Celluar proliferation in vessel wall was dynamically changed after balloon angioplasty injury. Antisense and decoy oligonucleotide of NF-κB by local lipofectamine transfer inhibit NF-κB activating gene modulation and neointimal hyperplasia.     

重组人白介素2-穿孔蛋白免疫毒素的制备及功能活性

以人白细胞介素2为载体，人Perforin为毒素，利用基因工程技术构建成pBV221／IL2－Perforom表达质粒，在大肠杆菌中成功地表达出IL2－Perforin重组毒素，SDS－PAGE获得分子量的20KD的蛋白条带，细胞毒测定对活化的人T淋巴细胞和IL2依赖株CTLL2有明显的杀伤作用，并且明显抑制同种混合淋巴细胞反应，这是一种性质全新的重组毒素，其杀伤机制不同于以往所用的毒素（PE，DT等）。这种新的重组毒素不仅有益于器官移植，也可能对自身免疫病的治疗带来新的方法。     

酵母双杂交系统筛选HBV PreS1相互作用蛋白

目的利用Sos招募系统(SRS),构建含HBV PreS1基因的酵母双杂交诱饵载体,筛选人肝细胞与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,进一步探讨HBV侵入肝细胞的机制。方法以HBV ayw亚型全长质粒PCP10为模板,PCR扩增HBV PreS1基因,克隆到酵母表达载体pSos中,构建诱饵质粒pSos-PreS1,将其转化cdc25酵母感受态细胞,提取酵母蛋白质进行Western blot分析,证实其在酵母细胞中的表达;将pSos-PreS1分别与pMyr Lamin C、pMyr SB共转化酵母,证实诱饵蛋白无自激活作用。将pSos-PreS1与人肝cDNA文库共转化cdc25酵母感受态细胞,通过营养及温度选择性培养筛选阳性菌落,扩增阳性菌落目的基因并测序。结果成功构建了HBV PreS1基因酵母双杂交诱饵载体pSos-PreS1,筛选得到5个准阳性克隆,序列分析表明其分别与人类钾通道调制因子1(KCMF1)、细胞色素C、VitD结合蛋白、人源去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)和人白蛋白具有高度同源性。结论利用SRS筛选出5个可能与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,为进一步了解HBV侵入肝细胞的机制奠定了基础。     

人乳头瘤病毒16型(湖北株)E7蛋白在NIH/3T3细胞中的表达和定位

目的　将带有人乳头瘤病毒 1 6型 (湖北株 )E7基因的真核表达载体 pL(E7 HB)SN导入NIH/3T3细胞进行瞬时表达。方法　重组质粒转染 3T3细胞通过DNA 磷酸钙共沉淀法 ;E7基因表达的检测采用RT PCR和间接免疫荧光实验。结果　E7基因导入真核细胞后能有效转录并表达E7蛋白 ,通过免疫荧光染色可看到E7蛋白主要定位在胞浆中 ,细胞核中也有 ,但量较少。结论　这可能和湖北株HPV1 6E7基因发生突变有关。     

聚合酶链反应检测弓形虫核酸的研究

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，设计了一对寡核苷酸引物，对弓形虫Ｂ１基因的保守序列进行体外扩增，显示该引物只对弓形虫核酸扩增，可对４个或４个以上弓形虫扩增出明显条带，检测弓形虫核酸的最低量为２．５ｐｇ。该ＰＣＲ对急性感染弓形虫的小鼠，于４８ｈ后就可从部分小鼠（２／５）的外周血中检测到弓形虫核酸，９６ｈ后全部小鼠（５／５）外周血中均检测到弓形虫核酸，而感染２４ｈ后可从其肝、脾、肾等组织中扩增到弓形虫核酸。对３４例孕妇外周血分别用ＥＬＩＳＡ及ＰＣＲ平行检测，ＥＬＩＳＡ测ＩｇＭ阳性者３例，ＰＣＲ扩增阳性者６例（其中３例ＩｇＭ亦阳性），表明ＰＣＲ具有较高的敏感性和特异性。     

Insertion Mutagenesis of Trichoderma atroviride by Restriction Enzyme-mediated DNA integration

The integration of transforming DNA mediat-ed by the in vivo action of restriction enzymes(RE-MI) was first described in yeast. Insertion mutage-nesis by REMI is a method that is being used togenerate mutations whose molecular basis can beeasily identified. REMI mutagenesis has a majoradvantage over classical mutagenesis in that themutants are marked with a molecular tag by themutagenic event. REMI has been described inmany organisms including the filamentous fungi,and its technology ha…