霜天蛾cDNA表达文库的构建和初步鉴定

目的构建霜天蛾cDNA表达文库,为进一步筛选霜天蛾主要变应原、制备重组变应原奠定基础。方法利用Trizol法抽提霜天蛾RNA,经过Oligo(dT)纤维素柱纯化后得到mRNA,反转录合成dscDNA,连接EcoRⅠ接头,末端磷酸化,XhoⅠ消化,将双末端黏性化的双链dscDNA经过凝胶柱层析,收集大于400bp的cDNA片段,加工后与UniZAPXRVector连接,经过体外包装,感染宿主菌,构建cDNA文库,检测文库容量和重组效率,并采用PCR方法对插入的cDNA片段大小进行分析。结果成功构建了一个含有5×105重组子的霜天蛾表达文库,重组率为67%,平均插入片段长度约为1.49kb。结论所建文库容量及插入片段大小合适,适用于筛选目的cDNA克隆。     

致过敏性哮喘的葎草花粉特异性变应原pTSX1 cDNA克隆的生物信息学分析

目的 对免疫学筛选鉴定获得的葎草花粉过敏哮喘特异性变应原阳性pTSX1 cDNA克隆进行生物信息学分析.方法 运用生物信息学的序列分析、序列比对、基因构成和蛋白质的结构及功能进行预测.结果 pTSX1 特异性变应原克隆序列分析表明,该克隆与现有的已知基因均无高度同源性.其序列有一615bp的开放阅读框(61～675bp),编码204个氨基酸.预测pTSX1蛋白的氨基酸序列编码蛋白很有可能为核糖体蛋白.结论 获得的葎草花粉过敏哮喘特异性变应原阳性pTSX1 cDNA克隆是一个新的基因,pTSX1基因编码的蛋白可能是核糖体蛋白.     

纯化葎草花粉变应原免疫治疗的研究

目的　观察纯化草花粉变应原特异性免疫治疗 (SIT)的疗效。方法　采取凝胶过滤方法部分提纯草花粉变应原。将 86例季节性草花粉过敏性哮喘患者随机分为纯化草花粉变应原SIT观察组 (A组 )及粗制变应原SIT对照组 (B组 ) ,采取双盲法 ,为时半年。观察临床疗效、副反应 ,以及SIT前后的T淋巴细胞亚群、皮肤试验 (IT)风团直径、嗜碱性粒细胞脱颗粒试验 (HBDT)指数及特异性IgE (sIgE)指数均值。 结果　A组总有效率 90 .7%(39/ 4 3) ,B组 79.1% (34/ 4 3,P <0 .0 5 )。A组SIT后仅 1例出现轻度副反应。两组SIT后CD4细胞及CD4/CD8显著降低 ,CD8细胞显著升高 ,且A组变化更明显。两组SIT后ID风团直径、HBDT指数及sIgE指数均值都较SIT前明显下降 (P均 <0 .0 1) ;A组SIT后上述指标下降程度较B组更明显 (P均 <0 .0 1)。结论　纯化草花粉变应原SIT的疗效优于粗制变应原 ,副作用小。提示纯化草花粉变应原SIT后对变态反应抑制性强于粗制变应原。     

葎草花粉主要变应原核酸疫苗pcDNA3.1-LC2的构建及其免疫原性鉴定

目的 构建葎草花粉主要变应原核酸疫苗pcDNA-LC2并鉴定其免疫原性.方法 将pTripIEx2-LC2质粒用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切得到LC2葎草花粉变应原基因片段,将其插入pcDNA3.1(-)真核表达载体,在鉴定重组质粒构建成功后,大量制备去内毒素核酸疫苗pcDNA3.1-LC2,应用pcDNA3.1-LC2核酸疫苗免疫小鼠,取免疫血清行双向免疫扩散实验,分析其免疫原性.结果 通过测序确认构建pcDNA3.1-LC2中的672bp的编码框碱基与原序列一致,没有突变及缺失.应用pcDNA3.1-LC2免疫BALB/c小鼠,经双向免疫扩散试验验证pcDNA3.1-LC2在小鼠体内可以表达并产生特异性抗体.结论 成功的构建了葎草花粉主要变应原核酸疫苗pcDNA3.1-LC2,pcDNA3.1- LC2可在小鼠体内表达,并能产生葎草花粉变应原特异性抗体,具有良好的免疫原性.     

葎草花粉变应原的研究进展与展望

变态反应性疾病是世界范围内重大卫生问题之一,近50%的变态反应性疾病患者对草类花粉过敏。葎草在我国分布广泛,是引起花粉症的主要致敏物之一。葎草花粉症患者呈逐年上升趋势,已受到人们广泛关注。本文从葎草花粉的致敏状况、主要致敏蛋白组分、葎草花粉症诊断和治疗方法的建立以及主要变应原重组等方面进行综述。     

葎草花粉致敏的小鼠肺部变应性炎症模型的建立

目的 建立葎草花粉粗浸液致敏激发的小鼠肺部变应性炎症模型.方法 24只BALB/c小鼠随机平均分为正常对照组和哮喘模型组.观察支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞总数和嗜酸性粒细胞百分比;HE染色观察葎草花粉粗浸液激发小鼠肺部变态反应性炎症;酶联免疫吸附试验检测BALF、脾组织匀浆中的细胞因子及血清总IgE抗体.结果 与正常对照组比较,模型组可诱导肺组织出现明显的变应性炎症,且病理炎症评分有统计学差异(P<0.01);BALF中的细胞总数、嗜酸性粒细胞(EOS)计数、IL-4,脾脏重量,脾组织匀浆IL-4和血清总IgE抗体均显著高于正常对照组(P<0.01).结论 葎草花粉粗浸液能够成功建立小鼠肺部变态反应性炎症模型.     

葎草花粉致敏蛋白多克隆抗体的制备及其在筛选致敏蛋白组分的应用

目的制备、鉴定兔抗葎草花粉蛋白多克隆抗体,并初步应用于葎草花粉致敏蛋白组分的筛选。方法用葎草花粉变应原浸液免疫兔,获得高效价抗葎草花粉蛋白抗血清,应用琼脂免疫双扩散、ELISA法以及Western blotting鉴定产生的抗体。同时对葎草花粉过敏性哮喘患者血清进行Western blotting检测。结果兔抗血清效价经ELISA检测,效价>1∶10000,免疫双扩散结果表明抗血清只与葎草花粉变应原形成特异性IgG沉淀线,Western blotting检测兔抗血清IgG可以特异性识别葎草花粉8种蛋白组分,分子质量分别为100、88、76、69、65、55、49、38 ku,患者血清IgG可以识别5种蛋白组分,分子质量分别为100、76、55、493、8 ku。结论制备的兔抗血清具有较高效价和较好的特异性,应用该血清筛选出的葎草花粉致敏蛋白组分与患者血清筛选的组分相似,因此可进一步应用于初筛cDNA表达文库。     

葎草花粉主要变应原核酸疫苗pcDNA3.1-LC2的真核细胞表达和免疫分析

目的 验证葎草花粉主要变应原核酸疫苗(pcDNA3.1-LC2)能否在真核细胞内表达,并进行免疫原性、免疫保护作用、安全性等分析.方法 应用磷酸钙沉淀法将pcDNA3.1-LC2转染至HEK293细胞,提取RNA并行RT-PCR,利用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物,验证所分离出的条带与目的 片段是否一致;应用pcDNA3...     

K562细胞cDNA表达文库的构建和鉴定

目的　构建K5 6 2细胞表达型cDNA文库。方法　提取K5 6 2细胞总RNA ,分离mRNA ,反转录合成双链cDNA ,消平cDNA末端 ,连接EcoRⅠ适配子 ,磷酸化EcoRⅠ适配子 5’端 ,Sephacryl S4 0 0柱除去小于 4 0 0bpcDNA片段 ,与去磷酸化的λgt11噬菌体连接 ,体外包装后建成cDNA文库。取出 1μL倍比稀释感染E .coliY10 90 ,测定文库大小、重组率 ,并以PCR鉴定cDNA插入片段的大小。结果　构建成含 1.0 2× 10 6重组子的K5 6 2细胞cDNA文库 ,重组子平均插入外源片段长约 1.3kb。结论　所建文库合格 ,适合用于筛选目的cDNA克隆。     

A NEW METHOD TO CONSTRUCT A FULL-LENGTH cDNA LIBRARY OF HUMAN NORMAL BLADDER TISSUE

ThepurposeoftheHumanGenomeProjectistounravelthe geneticinstructionsencodedbygenes.Identificationof protein codingandfunc tionalsequenceswithin genomeDNAcomplementthephysicalandgeneticmappingwork ,whichlaysfoundationforfurtherresearchintocomplexphe nomenaofgrowth ,development,differentiation ,carcinogenesis,etc.ThesearchforgenesresponsibleforhumandiseasesandbiologicalfeaturesandthestudiesoftheirstructuresandfunctionsrelyontheavailabilityofhighfidelitycDNAlibrariesfromvariouscelltypesandtissu…     

放射抗拒性鼻咽癌细胞系的建立及差异表达基因

目的 筛选同一来源放射敏感性不同鼻咽癌细胞基因差异表达,探讨鼻咽癌放射抗拒机理.方法 用X射线间歇多次照射鼻咽癌细胞株CNE-2建立放射抗拒性细胞CNE-2R,采用BioStarH-141s型基因芯片检测CNE-2与CNE-2R差异表达基因.结果 CNE-2和CNE-2R细胞有差异表达的基因308条,上调176个,下调132个.在差异表达的基因中,有76个位点出现6倍以上的差异,其中36个下调、40个上调,包括与DNA修复相关、细胞周期、凋亡、细胞骨架相关蛋白、细胞增殖、代谢、蛋白质合成、信号转导、免疫相关等方面相关的基因,基因分布变化较明显的主要是DNA修复相关基因、细胞骨架、细胞周期和凋亡相关基因.结论 CNE-2细胞反复照射后产生放射抗拒性细胞,在基因水平上发生了某些突变,通过调控其中相关基因,就有可能调控细胞的放射敏感性.     

人GLUT4基因的克隆及原核表达的初步实验研究

目的　通过反转录聚合酶链方法 ,从人新鲜手术肌肉组织获得人葡萄糖转运子 4 (GLUT4 )cDNA基因 ,并分别克隆入测序载体、表达载体 ,获得具有正确序列的目的基因及其原核表达产物 ,为其进一步的抗体制备、活性鉴定及研究应用奠定物质基础。方法　经GenBank在线检索 ,设计、确定人GLUT4cDNA基因特异引物 ,采用反转录聚合酶链 (RT PCR)方法从一例手术的人新鲜腹部肌肉组织总RNA模板中 ,获得人GLUT4表达片段cDNA的基因 ,经克隆入测序载体pGEM 3zf(- )测序 ,验证cDNA大小、完整性及序列。再克隆入表达载体 pBV2 2 0 ,经温度诱导 ,在E .coli获得表达。结果　以设计的特异引物 ,从人肌肉组织模板中能得到预期大小完整的人GLUT4cDNA基因 ,并能插入预定的克隆载体中测序 ,所得基因的序列与目的基因的序列相符。所获GLUT4cDNA基因插入原核非融合表达载体pBV2 2 0 ,获得预期大小的重组表达产物。结论　从人肌肉组织中能获得具有正确序列、含完整起始及终止密码的人GLUT4cDNA基因。该人GLUT4cDNA基因的体外重组体能在原核表达系统表达