人脐带间充质干细胞的分离培养及向成骨成脂分化的实验研究

目的 探讨并优化人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)体外获取及培养增殖的方法并鉴定;诱导其向成骨细胞和脂肪细胞分化,为其进一步应用奠定基础.方法 用酶消化法分离培养hUCMSCs,通过传代培养、扩增,倒置光学显微镜及原子力显微镜下观察细胞形态;MTT法检测细胞增殖曲线,流式细胞仪检测免疫表型;体外向成骨、脂肪方向诱导分化,并通过特异性染色鉴定其分化能力.结果 采用酶消化法能有效分离纯化hUCMSCs.接种24h,贴壁细胞形态多为长梭型、多边形或成纤维细胞样形态,大小均一.P3、P7代细胞的生长曲线基本一致,增殖能力强.流式细胞仪分析,第3代细胞强烈表达CD29、CD44、CD105,不表达CD34、CD45和HLA-DR.经成骨诱导分化后4周,碱性磷酸酶染色呈强阳性,茜素红染色可见明显钙结节;经成脂诱导3周,油红O染色呈阳性,有明显的脂滴出现.结论 本实验建立了一套体外稳定培养扩增hUCMSCs的方法.所培养的细胞成分单一、扩增迅速、生物学形状稳定,并能使其在体外诱导向成骨细胞和脂肪细胞分化,有望成为组织工程较为理想的种子细胞.     

低强度间断负压诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

目的利用低强度间断负压诱导人骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞定向分化。方法分离人骨髓,利用梯度离心法进行MSCs的培养,取第三代细胞利用低强度间断负压诱导分化;倒置显微镜下观察细胞的形态,检测碱性磷酸酶(ALP)活性,茜素红染色观察钙结节形成,免疫组织化学检测Ⅰ型胶原和骨保护素的表达。结果低强度间断负压诱导2周后,细胞呈现出成骨细胞形态,ALP活性明显增强,茜素红染色可见钙结节形成,Ⅰ型胶原和骨保护素表达阳性。结论利用低强度间断负压可以成功的诱导MSCs向成骨细胞定向分化,诱导的细胞具有典型的成骨细胞特性。     

大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化及体外诱导实验

目的建立骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离培养体系,进行骨向分化诱导,并将诱导的成骨细胞复合钛网体外成骨,为MSCs进一步的临床应用研究提供实验依据。方法用密度梯度离心法分离大鼠骨髓MSCs,并对其形态学特征进行观察。用诱导剂对MSCs向成骨细胞进行诱导分化,并进行形态学观察和免疫细胞化学检测。用扫描电镜观察骨向诱导后细胞复合钛网的情况。结果用密度梯度离心法成功分离获得了高纯度的骨髓MSCs。经骨向诱导后,ALP和矿化结节染色阳性。扫描电镜可观察到骨向诱导后细胞复合在钛网表面有矿化的基质沉积。结论成功建立了大鼠骨髓MSCs体外分离和培养体系,MSCs能够向成骨细胞分化,骨向诱导后细胞复合钛网体外有矿化的基质。     

成人脂肪源Flk1~+CD31~-CD34~-细胞体外定向诱导分化为胰岛样细胞

目的体外定向诱导成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞向胰岛样细胞分化。方法首先将成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞培养在含适当浓度的B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及表皮生长因子(EGF)的培养基中诱导,接着更换诱导培养基,用含适当浓度的β细胞调节素、尼克酰胺等高糖无血清培养基诱导细胞向胰岛样细胞分化。用RT-PCR法检测诱导前后nestin、ngn3、胰岛素启动子因子1(IPF-1)、胰岛素及胰高血糖素基因的表达;免疫荧光染色法检测诱导前后nestin、胰岛素及胰高血糖素的表达;放射免疫分析法检测诱导前后细胞分泌胰岛素情况。结果成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞经第一阶段的诱导后可分化成nestin阳性的祖细胞,继续诱导6 d后变圆的细胞逐渐增多,并最终聚集成团。免疫荧光实验证明经诱导后的细胞表达胰岛素、胰高血糖素、生长抑素等内分泌激素;放免分析结果表明,诱导的胰岛样细胞团可以分泌胰岛素。结论成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞具有胰腺干祖细胞的固有特征,极有可能作为种子细胞用糖尿病的细胞治疗。     

子宫内膜基质干细胞的体外成骨诱导和成脂诱导分化

目的探讨子宫内膜基质干细胞的多向分化潜能。方法取因子宫肌瘤行全子宫切除术患者的子宫内膜组织,磁珠分选子宫内膜基质干细胞,进行传代培养。传代细胞分别加入成骨诱导剂和成脂诱导剂培养,并通过茜素红和油红O染色对成骨细胞和脂肪细胞形态进行鉴定。结果子宫内膜基质干细胞呈成纤维细胞样贴壁生长,其经成骨、成脂诱导培养3周后形态、体积发生明显改变。茜素红染色显示细胞团中央能形成钙化结节;成脂诱导后油红O染色可见细胞质内出现橙红色脂滴。结论子宫内膜基质干细胞经体外诱导培养后可向成骨细胞和脂肪细胞分化,并具有明显的成骨和成脂细胞形态,表明子宫内膜基质干细胞具有多向分化潜能。     

神经递质P物质通过调控转录因子Osterix的表达促进成骨细胞分化

目的 研究神经递质P物质调控成骨细胞分化的分子途径.方法 分离骨髓基质干细胞进行原代及传代培养;分别采用空白对照、P物质、P物质NK1受体拮抗剂、P物质+P物质NK1受体拮抗剂进行干预,诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化;传代培养1～2周后,抽提细胞总RNA,用RT-PCR检测分化过程中Osterix基因的表达.检测结果重复3次,采用单因素方差分析检测结果.结果 骨髓基质干细胞在生长对数增殖期为4～6 d,采用RT-PCR检测发现P物质干预成骨细胞分化,导致成骨细胞分化过程中重要的转录引子Osterix 基因表达,与其他各组比较有显著差异(P<0.05),Osterix基因表达上调,从而刺激前成骨细胞向成骨细胞转化.而P物质+P物质NK1受体拮抗剂共同干预,Osterix基因表达与空白对照组无显著差异(P<0.05),说明P物质通过P物质NK1受体对成骨细胞分化进行调控.结论 P物质可调控前成骨细胞分化过程中转录因子Osterix基因表达促进其向成骨细胞分化.P物质对Osterix基因表达的调控依赖P物质NK1受体.     

生长因子诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化的研究

目的　建立一种体外分离兔骨髓间充质干细胞 (MSCs)的方法 ,诱导其表达软骨细胞表型。方法　抽取兔骨髓 ,经密度梯度离心和粘附分离得到MSCs。用生长因子诱导 ,观察细胞的增殖情况和软骨特异性基质的表达水平。结果　①纤维粘连蛋白促进MSCs贴壁 ,可提高细胞分离率 ;②TGF β1 ,IGF Ⅰ和维生素C结合可促进MSCs增殖 ,表达软骨特异性的Ⅱ型前胶原mRNA和基质蛋白多糖成分。结论　①密度梯度离心结合粘附分离可提高MSCs的分离效率。②TGF β1 ,IGF Ⅰ和维生素C结合诱导可促进MSCs增殖 ,表达软骨细胞表型     

大鼠来源脂肪干细胞的分离培养及其分化能力的检测

目的分离、培养及鉴定SD大鼠来源脂肪干细胞,为后续实验选取合适的种子细胞奠定基础。方法切取SD大鼠腹股沟处皮下脂肪,利用酶原消化合并差速贴壁的方法获得细胞,在倒置相差显微镜下观察细胞形态和增殖特征,测定其生长曲线,进行冻存复苏实验。第3代细胞在成骨诱导液作用下向成骨方向分化,进行Ⅰ型胶原染色、碱性磷酸酶染色、茜素红染色;使用成脂诱导液诱导其向成脂方向分化,进行油红O染色。结果从大鼠脂肪组织获得的细胞,呈成纤维细胞样生长;经成骨诱导液培养后,表现出成骨细胞特性,Ⅰ型胶原染色、碱性磷酸酶染色、茜素红染色均呈阳性;经成脂诱导液培养后,表现出脂肪细胞特性,油红O染色后,胞浆内可见脂肪滴。脂肪干细胞在液氮中冻存2个月复苏后,其生长增殖活性和多向分化能力没有明显降低。结论成功分离和培养大鼠脂肪干细胞,获得的细胞增殖旺盛,具有多向分化潜能,为后期运用组织工程技术修复组织损伤,提供了坚实的基础。     

人骨髓间充质干细胞生物学特性及腺病毒介导的GFP标记

目的建立人骨髓间充质干细胞(hMSCs)分离、培养以及鉴定的方法,同时应用腺病毒介导的绿色荧光蛋白(Ad-GFP)检测细胞转染的效率。方法应用人淋巴细胞分离液(Ficoll)对hMSCs进行分离,经贴壁纯化后用MTT法检测增殖能力;并对其成骨、成脂、成平滑肌诱导分别进行碱性磷酸酶(ALP)、油红O染色及α-SMA免疫细胞化学检测;采用流式细胞仪(FCM)检测细胞表面标志的表达。用Ad-GFP转染,并应用荧光显微镜与FCM检测转染效率。结果 hMSCs镜下为成纤维样形态,约在第4天进入对数增长期;分化诱导后ALP染色、Von kossa银染、油红O染色以及α-SMA均为阳性;FCM检测CD14、CD31、CD45表达阴性,CD44、CD73、CD106及PDGFRβ表达阳性;当感染复数MOI=200,细胞培养48h时感染效率较高,FCM检测显示为99.81%。结论经过对增殖、分化能力以及表面标志的分析,证明用Ficoll可以分离得到较纯的hMSCs,Ad-GFP可以很好地感染细胞,为组织工程种子细胞的体内示踪提供了途径。     

豚鼠骨髓间充质干细胞培养及成骨细胞定向分化

目的　分离和培养豚鼠骨髓间充质干细胞 ,研究其成骨细胞分化特性。方法　采用成年豚鼠用贴壁法分离骨髓间充质干细胞并传代培养。取第三代培养细胞做细胞生长曲线测定。用 β 甘油磷酸钠、地塞米松和维生素C诱导使其向成骨细胞分化。Gomori钙钴法作碱性磷酸酶染色。结果　全培养骨髓细胞 ,连续 3d换液后能得到均一的骨髓间充质干细胞。豚鼠骨髓间充质干细胞群体倍增时间为 6 1h。用 β 甘油磷酸钠、地塞米松和维生素C诱导可以使其成骨细胞分化。碱性磷酸酶染色阳性。结论　贴壁法可用于分离骨髓间充质干细胞。豚鼠骨髓间充质干细胞具有药物诱导定向成骨细胞分化的特性     

兔骨髓基质干细胞的体外培养及生物学活性研究

目的 体外分离培养、鉴定兔骨髓基质干细胞(BMSCs)并探讨其分化潜能.方法 应用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法,体外分离培养兔骨髓来源的骨髓基质干细胞,培养过程中倒置显微镜下观察其生物学特性,HE染色和CD34、CD44免疫组织化学染色行细胞学鉴定;应用体外成骨与成脂诱导分化检测其生物学活性.结果 体外实验成功分离培养兔BMSCs,HE染色显示细胞均一性好;CD44强阳性表达,CD34阴性表达.诱导成骨结果显示BMSCs具有较强的成骨活性,ALP染色阳性;成脂诱导结果显示BMSCs具有较强的成脂活性,油红"O"脂肪染色阳性.结论 BMSCs体外具有潜在的多向分化能力.     

TGF-β诱导骨髓干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的探讨转化生长因子β(TGF-β)对骨髓间充质干细胞(MSCs)定向分化为心肌样细胞的影响。方法取SD大鼠四肢骨骨髓,分离培养MSCs,应用TGF-β1对第二代MSCs定向诱导,相差显微镜观察细胞形态学变化,应用免疫细胞化学技术检测诱导后4周MSCs结蛋白(desmin),α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)、心肌肌钙蛋白T(CTnT)及p38MAPK的表达情况,并根据CTnT这一心肌源性特异性标记物的阳性率,分析心肌细胞的转化率;同时,以半定量RT-PCR方法在诱导后7、21、28d检测细胞心肌早期转录因子GATA-4和心肌特异性肌凝蛋白重链α-MHC的表达。结果①加入TGF-β1诱导后的MSCs,于7d时形态已转变成类长柱形,28d时细胞体积则变小,呈条梭状排列,可观察到类肌管样结构。②TGF-β1诱导4周后的MSCs均可见desmin、α-sarcomeric actin及p38MAPK阳性细胞。诱导组的心肌样细胞转化率均显著高于对照组(P均<0.01)。③RT-PCR结果显示,诱导组细胞GATA-4于诱导后7d弱表达,21d表达增强,28d表达减弱。α-MHC在诱导后7d不表达,21d弱表达,28d表达明显。结论骨髓间充质干细胞在TGF-β诱导下可定向分化为心肌样细胞。     

体外诱导人脐血CD34~+细胞向肝细胞的分化

目的探讨在体外培养条件下人脐血CD34+细胞向肝细胞的分化。方法用磁性细胞分选试剂盒(MACS)分离出CD34+细胞后在含50 mL/L FBS,1×ITS,4.7 mg/L亚油酸,10-4mol/L 2-磷酸抗坏血酸的低糖型DMEM中培养,并以FGF4(100μg/L)、HGF(20μg/L)进行诱导。分别于生长因子刺激前和刺激8、16 d时留取细胞。通过RT-PCR对ALB、AFP、GATA-4等mRNA的表达水平进行检测;用免疫细胞化学染色检测ALB蛋白的表达,并收集培养液测定ALB的质量浓度。结果流式细胞仪检测结果显示CD34+细胞的平均分离纯度>90%,达到分离要求。RT-PCR检测到诱导后的CD34+细胞表达ALB、AFP、GATA4 mRNA。免疫细胞化学染色可见诱导16 d的CD34+细胞出现ALB阳性表达细胞,ELISA检测表明诱导组8、16 d培养液中的ALB质量浓度明显增高,与诱导前和未诱导组相比均有显著差异(P<0.01)。结论在体外培养条件下,脐血CD34+造血干细胞可分化为表达白蛋白的类肝细胞。     

雄黄对急性早幼粒细胞白血病细胞诱导凋亡和促进分化的双重作用

目的　了解雄黄治疗急性早幼粒细胞白血病 (APL)的机制。方法　以APL细胞株NB4细胞为体外模型 ,应用透射电镜观察细胞形态 ,MTT检测细胞生长增殖状态 ,流式细胞仪检测细胞凋亡 ,NBT还原试验反映细胞分化能力 ,并检测细胞表面分化抗原CD11b、CD3 3 表达的改变。结果　雄黄作用后 ,细胞同时出现凋亡和分化相关的形态改变 ;超微结构发现凋亡小体 ,同时部分细胞内出现分化颗粒 ;流式细胞仪检测线粒体膜表面抗原APO 2 .7表达上调 ;CD11b表达增加 ,CD3 3 表达减少 ,其调变程度弱于全反式维甲酸。结论　雄黄对急性早幼粒细胞白血病细胞同时具有诱导凋亡和促进部分分化的双重效应。     

骨髓间质干细胞的分离培养与鉴定

目的建立兔骨髓间质干细胞(MSCs)的体外分离纯化、扩增和鉴定的方法,为MSCs的进一步诱导分化和应用奠定基础。方法抽取兔胫骨骨髓,密度梯度离心,得到骨髓单个核细胞,接种后形成单层贴壁细胞,经胰蛋白酶消化后传代培养扩增,倒置显微镜下观察原代和传代细胞的生长特性。通过免疫荧光组织化学、流式细胞分析和透射电镜鉴定细胞。结果分离培养的骨髓MSCs贴壁、呈梭形,原代细胞呈集落生长,7～10d达到融合,传代后增殖速度加快;骨髓MSCs表达CD90,反复传代后表达效率增高,不表达CD34;透射电镜可见细胞表面有大量的绒毛突起,胞浆中有丰富的粗面内质网和线粒体,核大,形态不规则。结论密度梯度离心结合贴壁法,以及消化传代能有效分离纯化和扩增骨髓MSCs,分离培养的细胞具有骨髓MSCs的基本表型和特性。     

转化生长因子β1对牙周膜干细胞迁移、粘附及增殖的影响

目的研究转化生长因子β1(TGF-β1)对牙周膜干细胞(PDLSCs)的迁移、粘附和增殖的影响,初步探讨TGF-β1通过影响牙周组织干细胞参与牙周改建的机制。方法分离培养人PDLSCs,鉴定其多向分化潜能。用Transwell法检测TGF-β1对PDLSCs的迁移的影响。用粘附实验检测TGF-β1对PDLSCs粘附能力的影响。用MTT法和生长率法检测TGF-β1对PDLSCs增殖的影响。结果浓度为2.5ng/mL以及10ng/mL的TGF-β1可促进PDLSCs的迁移,而且此作用呈剂量效应关系。粘附实验结果显示,在分别作用2h和4h后,浓度为10ng/mL的TGF-β1可促进PDLSCs的粘附。MTT法的结果证实了TGF-β1可促进PDLSCs的增殖,该作用呈剂量效应关系。再将细胞在含有或者不含有10ng/mLTGF-β1的培养基中培养2、4、6d,对细胞进行计数后发现TGF-β1显著促进PDLSCs的生长。结论 TGF-β1可促进PDLSCs的迁移、粘附和增殖。推测TGF-β1可能通过诱导PDLSCs向牙周组织部位迁移并提高其粘附和增殖能力。     

miR146通过靶向Notch 1促进骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化

目的探讨miR146在骨髓间充质干细胞(BMSC)向髓核样细胞分化中的作用及其机制。方法从SD大鼠中分离培养BMSC,传至第3代用于本实验。以TGFβ1(转化生长因子-β1)诱导BMSC向髓核样细胞分化为模型。检测TGFβ1诱导BMSC后蛋白多糖(ACAN)、Ⅱ型胶原蛋白(COLⅡ)和SOX 9的蛋白及mRNA表达水平;RT-PCR检测miR146的表达水平。随后通过上调或下调miR146水平,检测ACAN、COLⅡ和SOX 9的蛋白及mRNA表达水平;双荧光素酶报告系统验证miR146的靶基因,并上调或下调miR146水平后检测靶基因的蛋白表达水平;过表达靶基因并检测其与miR146 mimic共转染对ACAN、COLⅡ和SOX 9表达的影响。最后,上调或下调靶基因后,检测miR146表达水平的变化。结果 TGFβ1诱导BMSC向髓核样细胞分化后ACAN、COLⅡ、SOX 9和miR146高表达。上调miR146后,ACAN、COLⅡ和SOX 9的表达升高;下调miR146后ACAN、COLⅡ和SOX 9的表达降低。双荧光素酶报告系统证实,Notch1是miR146的靶基因,miR146通过抑制Notch1的表达上调ACAN、COLⅡ和SOX 9的表达水平。上调Notch1后miR146表达下调,下调Notch1后miR146表达上调。结论 miR146通过靶向Notch1促进骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化,Notch1对miR146亦具有负向调控作用。     

细菌脂多糖促进RANKL预处理的破骨前体细胞转向成熟分化的调节作用

目的研究细菌脂多糖(LPS)直接促进破骨细胞分化的调节作用。方法建立RANKL和M-CSF诱导骨髓单核细胞分化为成熟破骨细胞的体外培养方法;采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)观察LPS对RANKL预处理的破骨细胞前体分化调节作用;RT-PCR检测LPS对RANKL预处理的破骨细胞前体表达TNF-α、IL-1β。结果 LPS通过刺激破骨前体细胞表达和分泌TNF-α、IL-1β促进破骨细胞向成熟分化,并且不依赖于RANKL-RANK途径。结论 LPS促进RANKL预处理的破骨细胞前体向成熟分化的途径可能是通过增加其自分泌TNF-α和IL-1β完成的。     

仿生骨小梁与规则多孔结构骨整合性能的体外细胞学对比研究

目的 探究相同孔隙率和孔径大小的仿生骨小梁与规则多孔结构对成骨细胞黏附、增殖、分化的影响,为钛合金植入体骨整合性能的改良提供理论依据。方法 利用计算机辅助软件生成相同孔隙率和孔径大小的仿生骨小梁与规则多孔结构,采用选择性激光熔融技术将其加工为直径10 mm、高3 mm的圆盘状Ti6Al4V支架。将处于生长对数期的小鼠成骨细胞前体细胞MC3T3-E1接种到两种支架上,分为仿生骨小梁组与规则多孔结构组。取培养3 h后的支架,进行吖啶橙染色和鬼笔环肽/DAPI染色,评估细胞黏附数量,取培养3 d后的支架进行扫描电镜检查,评估细胞的黏附状态。取培养1 d、3 d、5 d后的支架,进行CCK8检测,观察细胞的增殖情况。取诱导分化7 d和14 d后的支架,检测碱性磷酸酶(ALP)活性;取诱导分化14 d后的支架,利用RT-PCR检测成骨相关基因(ALP、OCN、RUNX2)的表达量;取诱导分化30 d的支架进行茜素红染色和100 g/L氯化十六烷基吡啶溶解矿化结节,定性和定量检测钙盐沉积,评估细胞分化情况。结果 吖啶橙和鬼笔环肽/DAPI染色结果显示仿生骨小梁Ti6Al4V支架较规则多孔结构黏附更...     

姜黄素对CD34~+CD38~-KG1a细胞增殖和凋亡的影响及其与白消安的协同效应

目的探讨姜黄素对CD34+CD38-KG1a细胞增殖和凋亡的影响以及姜黄素联合白消安对CD34+CD38-KG1a细胞的协同效应。方法流式细胞术检测细胞CD34、CD38表面抗原的表达情况、姜黄素诱导CD34+CD38-KG1a细胞的凋亡情况及其对CD34+CD38-KG1a细胞周期的影响。MTT法检测姜黄素对CD34+CD38-KG1a的增殖抑制作用及其与白消安联合作用的效应。甲基纤维素克隆形成实验检测细胞克隆形成能力。倒置光学显微镜观察细胞凋亡形态。Western blot检测Bcl-2蛋白表达水平。结果 KG1a细胞株中CD34+CD38-KG1a细胞占(98.2±3.2)%。姜黄素对CD34+CD38-KG1a细胞具有增殖抑制作用,呈时间-剂量依赖性,并能降低CD34+CD38-KG1a细胞的克隆形成能力。姜黄素与白消安相互作用系数(CDI)<1。CD34+CD38-KG1a细胞被姜黄素阻滞于G0/G1期,S期细胞明显减少,并能诱导CD34+CD38-KG1a细胞凋亡。凋亡细胞体积变大,细胞结构不清,胞膜边缘粗糙。姜黄素能下调CD34+CD38-KG1a细胞Bcl-2蛋白表达水平。结论姜黄素通过降低细胞克隆形成能力、阻滞细胞于G0/G1期和诱导细胞凋亡,抑制CD34+CD38-KG1a细胞的增殖,姜黄素与白消安具有协同作用。Bcl-2蛋白表达水平下调可能促使姜黄素诱导CD34+CD38-KG1a细胞凋亡。