实时荧光定量PCR检测宫颈癌组织中HGF mRNA和c-Met mRNA的表达

目的检测宫颈癌组织中肝细胞生长因子(HGF)及其受体原癌基因c-Met的分子表达水平,并探讨其临床意义。方法采用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)技术检测43例宫颈癌,30例宫颈上皮内瘤变Ⅲ和27例正常宫颈组织标本中HGF和c-Met的分子表达水平。结果 HGF mRNA和c-Met mRNA在宫颈癌组织中均呈高表达,其与宫颈癌患者临床分期、肿瘤直径大小、浸润深度、淋巴结转移有关(P均<0.05),而与肿瘤的分化程度无关(P>0.05)。HGF mRNA和c-Met mRNA之间存在正相关(r=0.666,P<0.01)。结论 QRT-PCR技术可对宫颈癌组织中的HGF mRNA和c-Met mRNA表达进行定量检测;HGF mRNA和c-Met mRNA的高表达与宫颈癌的侵袭转移有关。两者联合监测有利于早期诊断宫颈癌,为宫颈癌的治疗和预后提供参考。     

小反应体积实时定量PCR的可行性评价

目的 从扩增稳定性、扩增效率以及可靠性等多方面评估实时定量PCR(RtPCR)反应小体积的可行性,同时确定适合小体积体系的模板量.方法 将实验分为10、15、20μL 3个体积组,每组分别采用0.1、0.2、0.3、0.4μL的大鼠cDNA为模板,进行大鼠β-actin mRNA的RtPCR扩增.通过扩增曲线和熔解曲线考察反应的稳定性,以梯度模板拟合标准曲线获得反应的扩增效率,其线性相关程度反映模板量是否合适.另外,构建大鼠降植烷诱导的关节炎(pristane-induced arthritis, PIA)模型,采用选定的反应体系,分别对模型组和正常组大鼠脾脏TNF-α mRNA进行扩增,通过TNF-α的相对表达趋势反映小体积扩增的可靠性.结果 在大鼠β-actin mRNA的RtPCR扩增中,10、15、20μL 3个体积组均能特异稳定地进行扩增,并保证高扩增效率.而且每个体积组中的模板梯度表现出很好的线性相关趋势.同时选用10μL和20μL反应体积、0.2μL模板对关节炎大鼠脾脏进行TNF-α mRNA扩增,结果一致表现出了预期的显著性上调.结论 实验证实10μL、15μL等小反应体积应用于RtPCR扩增中是可行的,具有较好的稳定性和可靠性,同时0.1～0.4μL cDNA模板在3种体系的合适模板范围内.这种较小的PCR反应体积,不仅节省了试剂和实验材料,对一些来之不易的临床标本尤为重要,也利于高通量大规模的RtPCR检测的实现.     

Construction and evaluation of reference standards for detection and quantification of Klebsiella pneumoniae using real-time PCR

Objective To construct reference standards for detection and quantification of Klebsiella pneumoniae (K.pneumoniae) with SYBR Green I-based real-time PCR assay. Methods Primers were designed based on the published sequence of the phoE gene of K.pneumoniae. The standard was prepared by cell culture, PCR and T-A clone methods, and was identified by colony PCR and DNA sequencing. Results The standard curve showed a very good linear negative regression between threshold cycle (Ct) and Log starting quantity of copy number. The detection range was from 5.2 to 5.2×106 copies per reaction, and the detection limit was 6 copies per reaction. The coefficients of variance (CVs) of three parallel experiments were in the range of 0.05%-0.91%. Conclusion The reference standards have high stability and reproducibility. They can be used in the quantitative detection of K.pneumoniae.     

层粘连蛋白及其受体在人正常绒毛、葡萄胎组织中的表达及意义

目的　探讨层粘连蛋白 (LN) ,层粘连蛋白受体 (LN R)与葡萄胎发生的关系。方法　采用免疫组织化学方法 ,观察正常人胚胎早期绒毛、葡萄胎组织中LN、LN R的表达情况。结果　LN在正常绒毛组织、葡萄胎组织基底膜着色呈连续线状 ,其表达与妊娠周数有关 ,随着妊娠周数的增加LN的表达呈下降趋势。正常绒毛组织、葡萄胎组织中LN R的表达位于上皮组织细胞膜上 ,呈阳性包绕状 ,且在偏离基底膜细胞表面着色较深。结论　推测LN R在细胞膜表面的分布可反映细胞的生长、浸润的方向 ,葡萄胎组织中LN、LN R的表达在研究葡萄胎发病机制上有一定的参考价值。     

Syncytin在正常妊娠及子痫前期胎盘组织中的表达及意义

目的探讨syncytin在正常妊娠及子痫前期胎盘组织中的表达及意义。方法采用荧光实时定量PCR(Real-time FQ-PCR)方法检测正常晚期妊娠(20例)、晚发型子痫前期轻度(20例)、重度(25例)及早发型重度子痫前期(15例)胎盘组织中syncytin mRNA表达。结果 Syncytin mRNA在正常妊娠晚期及子痫前期胎盘组织中均有表达;晚发型子痫前期与正常晚孕比较,胎盘组织syncytin mRNA表达降低,且与病情严重程度相关;早发型与晚发型比较,早发型重度子痫前期表达降低更为明显,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 Syncytin mRNA在子痫前期胎盘组织中表达降低,早发型降低更为明显,而syncytin与滋养细胞融合有关,提示滋养细胞融合障碍可能在子痫前期发病中发挥作用。     

层黏连蛋白及其受体在正常绒毛和绒癌组织中的表达及意义

目的探讨层黏连蛋白(LN)及层黏连蛋白受体(LN-R)与滋养细胞侵袭的关系。方法采用免疫组织化学的方法,观察正常早期妊娠绒毛和绒癌组织中LN、LN-R的表达。结果在正常绒毛组织中从绒毛、细胞柱到浸润的绒毛外滋养细胞,随着滋养细胞侵袭力的增加,LN及LN-R的表达呈下降趋势。绒癌组织的LN表达较正常绒毛明显减弱,两组间比较有显著性差异(P<0.05)。结论在滋养细胞侵袭的过程中,LN和LN-R起着重要作用。     

两种实时定量RT-PCR方法检测miRNAs表达的技术分析

目的比较两种实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)方法检测microRNAs(miRNAs)表达含量的技术差异,优化不同实验目的和条件下研究miRNAs表达的技术方法。方法取21d和42d两个时间点的SD大鼠关节软骨组织,采用Trizol法提取总RNA备用。选取rno-miR-15b、rno-miR-16、rno-miR-195、rno-miR-497作为研究对象,分别用茎环引物和试剂公司提供的试剂盒方法反转录总RNA,并应用实时定量PCR方法检测这些miRNAs的表达量。提取人血浆中总RNA,用上述两种RT-qPCR方法实时定量检测has-miR-16的表达量。结果两种方法检测这些miRNAs表达量,在大鼠21d和42d这两个时间点其表达量变化趋势相同,都呈现增高的趋势,这与我们前期Solexa测序结果相同。在血浆中的结果显示,其中茎环引物反转录方法灵敏度相对较高。结论茎环引物法在少量几个重要的miRNAs检测中具有优势,而试剂盒方法适用于大量miRNAs的筛查。     

HtrA1在正常孕妇血清及胎盘组织中的表达及其意义

目的探讨HtrA1(high temperature requirement A1,HtrA1)在正常孕妇血清及胎盘组织中的表达及其意义。方法采用酶联免疫吸附试验法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)序贯测定1 812例孕妇早、中、晚孕期血清HtrA1浓度;应用免疫组化SABC法检测正常早孕(15例)、中孕(10例)、晚孕(18例)胎盘组织中HtrA1的表达。结果正常孕妇孕期血清HtrA1浓度分布呈对数正态分布,随着孕周的增加,浓度逐渐升高,孕17～20周达峰值;正常妊娠时,随着孕周增加胎盘组织HtrA1表达逐渐增高(平均灰度值与表达强度成负相关),在早期、中期及晚期妊娠平均灰度值分别为156.28±3.12、153.37±2.54和148.69±2.31,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 HtrA1与正常胎盘的发育有关,可能通过不同的作用机制参与不同时期胎盘的形成。     

滋养细胞疾病和妊娠绒毛组织中端粒酶的表达

目的　明确妊娠滋养细胞疾病和正常绒毛组织中的端粒酶表达状况 ,探索端粒酶活化在滋养细胞肿瘤形成中的作用。方法　应用以聚合酶链反应为基础的端粒酶测定方法 (TRAP) ,对不同临床类型妊娠滋养细胞疾病及不同发育阶段正常妊娠绒毛组织共 61例的端粒酶活性进行检测。结果　绒毛膜癌及侵蚀性葡萄胎 36.4% (4/1 1 )端粒酶阳性 ,葡萄胎 2 6.3% (5/1 9)阳性 ;早孕 60 d以内绒毛全部 (1 0 /1 0 )阳性 ,此期以后的胎盘组织 (2 1 /2 1 )阴性。结论　端粒酶在妊娠早期以后表达受到抑制 ,其活化在滋养细胞肿瘤形成中可能起重要作用 ;其测定对此类疾病的诊断、预后和疗效评定有潜在价值     

正常绒毛和葡萄胎中Mel-CAM标记中间型滋养细胞的增殖情况

目的探讨葡萄胎中Mel-CAM与滋养细胞黏附、浸润之间的关系以及Mel-CAM标记中间型滋养细胞(IT)的增殖情况。方法采用双重免疫组化法,检测Mel-CAM标记IT的Ki-67表达情况。结果葡萄胎中Mel-CAM表达较正常绒毛明显增高,差异有统计学意义(P<0.05);葡萄胎绒毛表面有Mel-CAM标记IT出现,而正常绒毛表面则无;葡萄胎组织中IT的Ki-67指数较正常绒毛明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论葡萄胎绒毛表面有Mel-CAM表达,表现出双重分化方向,这可能与葡萄胎的发病机制有关;检测葡萄胎组织中IT的Ki-67指数对于预测葡萄胎的转归有潜在的价值。     

胎盘组织中Human Annexin V的表达及与HBV感染的关系

目的观察Human AnnexinV(HAV)在胎盘组织中的表达,并探讨其在乙型肝炎病毒(HBV)感染胎盘中的可能作用。方法用免疫荧光染色法检测早孕绒毛,中孕和足月胎盘绒毛中HAV的表达;用免疫荧光双重染色法观察HBV感染的胎盘组织HBsAg和HAV的分布及相互关系。结果①所有的标本绒毛滋养层细胞、绒毛间质细胞、毛细血管内皮细胞都有HAV的存在。②HBV感染的胎盘绒毛中只要是HBsAg阳性的部位同时一定有HAV的表达,阳性信号存在于滋养层细胞、绒毛间质细胞、绒毛毛细血管内皮细胞中。结论HAV可能作为HBsAg的特异性受体介导了HBV与胎盘组织各层细胞的粘附、内化等过程并最终导致了HBV对胎盘的感染。