人MCHR1真核表达载体构建及稳定转染HEK293细胞系的建立

目的构建人MCHR1真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染的HEK293细胞系。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HEK293细胞系,用RT-PCR、Western-blot检测MCHR1的表达。结果构建了pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体,建立了稳定转染的HEK293细胞系,并成功地表达了目的基因。结论真核表达载体成功构建和稳定转染HEK293细胞系的建立为进一步研究MCHR1的功能奠定了良好的实验基础。     

转化生长因子β与碱性成纤维细胞生长因子在术后腹腔粘连组织中的表达及其意义

目的研究转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor,bFGF)的表达水平和微血管密度(microvessel density,MVD)与人体腹腔粘连发生的关系,探索血管生成在术后腹腔粘连发生发展中的作用。方法 40例二次开腹手术粘连腹膜标本,20例初次开腹手术腹膜标本,分别作为粘连组和对照组。用免疫组化染色方法对TGF-β、bFGF的表达水平及MVD行相应分析。结果 TGF-β、bFGF在粘连组织中的阳性高表达率分别为65.0%、70.0%,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β、bFGF高表达组的MVD值较其低表达组的MVD值明显增高,差异均有统计学意义(P<0.05);TGF-β、bFGF与MVD间存在正相关(r>0,P<0.05)。结论 TGF-β、bFGF参与人体术后腹腔粘连的发生及发展,它们参与粘连形成的机制可能与其促进粘连组织中血管生成有关。     

VEGF-C、CXCR4在乳腺浸润性导管癌组织中的表达及意义

目的分析血管内皮生长因子-C(VEGF-C)、趋化因子受体-4(CXCR4)在乳腺浸润性导管癌组织及乳腺纤维腺瘤组织中的表达,探讨其与淋巴管生成、乳腺癌的淋巴转移的关系。方法应用免疫组织化学方法检测72例乳腺癌组织、15例乳腺纤维腺瘤中VEGF-C、CXCR4的表达。结果 72例乳腺癌组织中VEGF-C、CXCR4的表达率分别为76.4%、58.3%,显著高于乳腺纤维腺瘤组织(20%、13.3%),差异有统计学意义(P<0.01)。VEGF-C、CXCR4的表达与患者的年龄、肿瘤大小、雌孕激素受体(ER、PR)的表达无关(P>0.05),而与组织学分级、临床分期、淋巴管的浸润及淋巴结转移有关(P<0.01)。结论 VEGF-C、CXCR4在介导乳腺癌细胞淋巴管浸润及淋巴结转移中可能起重要协同作用。     

PDGFR信号通路促进星形胶质细胞和成纤维细胞共培养时细胞簇的成团效应

目的探讨血小板衍生生长因子受体(PDGFR)信号通路对小鼠脑星形胶质细胞和成纤维细胞共培养体系增殖的影响。方法取出生1～3 d的小鼠乳鼠大脑皮质培养星形胶质细胞,取脑膜培养成纤维细胞,免疫细胞化学荧光染色胶质纤维酸性蛋白(GFAP)鉴定星形胶质细胞纯度,染色纤连蛋白(FN)鉴定成纤维细胞纯度。通过向小鼠脑星形胶质细胞和成纤维细胞共培养细胞体系中加入细胞因子血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)刺激细胞或抑制剂AG1296进行干预,观察各组细胞增殖情况,Western blot检测共培养细胞系中p-PDGFR-β、磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)的表达变化。结果鉴定结果显示星形胶质细胞和成纤维细胞的细胞纯度达到90%。显微镜下观察显示,加入PDGF-BB后星形胶质细胞和成纤维细胞共培养体系增殖明显并形成团块,给予抑制剂AG1296则增殖受到抑制,团块明显减少。Western blot结果显示加入PDGF-BB时,p-PDGFRβ、p-Akt表达增多(P<0.01);给予抑制剂AG1296则表达减少(P<0.05)。结论 PDGFR信号通路促进体外小鼠脑星形胶质细胞和成纤维细胞的增殖。     

脑缺血组织nestin蛋白重新表达及其与碱性成纤维细胞生长因子表达的关系

目的　研究缺血脑组织nestin蛋白重新表达和碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)表达的关系。方法　建立永久性脑缺血大鼠模型 ,采用免疫组化染色方法 ,观察脑缺血后 1、3、7、14、2 8d脑组织nestin蛋白和bFGF的表达。结果　缺血后 1～ 3d缺血灶附近nestin免疫阳性细胞大量出现 ,缺血 7d开始减少 ;而bFGF免疫阳性细胞在缺血 14d大量出现 ,缺血 2 8d开始减少。结论　缺血脑组织重新表达nestin蛋白不需要bFGF的营养和支持 ,缺血脑组织周围的nestin免疫阳性细胞来源于重演胚胎发育过程的星形胶质细胞     

SDF-1及其受体CXCR4在上皮性卵巢肿瘤中的表达及意义

目的探讨趋化因子SDF-1及其受体CXCR4在上皮性卵巢肿瘤组织中的表达及临床意义。方法应用免疫组织化学SP法检测10例正常卵巢上皮组织、21例卵巢良性肿瘤、19例交界性卵巢肿瘤、30例卵巢癌原发灶和11例相应盆腔腹膜转移灶组织中SDF-1和CXCR4蛋白表达情况。结果正常卵巢上皮组织SDF-1和CXCR4表达阴性,卵巢良性肿瘤低表达SDF-1(9.52%),CXCR4表达阴性,与正常卵巢及良性卵巢肿瘤相比,交界性卵巢肿瘤、卵巢癌原发灶及转移灶表达较高水平的SDF-1与CXCR4(63.16%、93.33%、90.91%;47.37%、63.33%、63.64%)。交界性卵巢肿瘤中SDF-1和CXCR4表达无显著相关性(P=0.460);而卵巢癌原发灶中SDF-1和CXCR4表达呈正相关(P<0.05);SDF-1的表达与卵巢癌患者的临床分期、组织学分级无显著相关性(P>0.05),而与患者有无腹水有一定相关性(P<0.05),CXCR4的表达与卵巢癌患者的临床分期、组织学分级及患者有无腹水无显著相关性(P>0.05)。结论SDF-1/CXCR4的表达与细胞的恶性转化有关,可能参与了卵巢恶性肿瘤的发生、发展、侵袭与转移。     

大鼠脑发育过程中碱性成纤维细胞生长因子的免疫组织化学研究

目的　研究碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)阳性细胞在大鼠不同发育时期不同脑区的分布。方法　应用免疫组织化学ABC法 ,对不同发育时期大鼠脑的嗅球、室管膜、室管膜下区、顶叶皮质、纹状体、海马进行bFGF免疫组织化学染色及光镜观察。结果　bFGF在脑内广泛表达 ,其表达强弱随年龄和部位不同而变化。E18～ 3d组bFGF阳性细胞显色较弱 ,以后各组显色较强。阳性细胞呈现胞浆或 (和 )核阳性。结论　bFGF在脑内分布广泛 ,其对中枢神经系统的发育及生长发挥重要作用     

高迁移率族蛋白B1和Toll样受体4与哮喘气道炎症的关系及维生素D的作用

目的探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)和Toll样受体4(TLR4)与气道炎症的关系及维生素D的作用。方法 BALB/c小鼠随机分为对照组、哮喘组和1,25-(OH)2D3干预组(每组8只)。采用HE染色观察小鼠肺组织病理学变化并应用计算机图像系统测定支气管壁厚度,采用免疫组化法观察肺组织HMGB1和TLR4表达,同时收集支气管肺泡灌洗液(BALF)和外周血,将BALF进行细胞学检测,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定BALF和外周血中HMGB1、TLR-4、白介素-4(IL-4)和干扰素-γ(IFN-γ)含量。结果哮喘组小鼠肺组织HMGB1和TLR4表达较强,干预组表达较弱。哮喘组BALF中白细胞总数及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞比例明显升高,单核/巨噬细胞比例明显下降(均为P<0.05);干预组BALF中白细胞总数及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞比例明显下降,单核/巨噬细胞比例明显上升(均为P<0.05)。哮喘组BALF和外周血中HMGB1、TLR4和IL-4含量均明显高于对照组,IFN-γ含量均明显低于对照组(均为P<0.05);干预组BALF和外周血中HMGB1、TLR4和IL-4含量均明显低于哮喘组,IFN-γ含量明显高于哮喘组(均为P<0.05)。BALF中HMGB1和TLR4含量分别与细胞总数和IL-4浓度均呈正相关(r1为0.796、0.730;r2为0.695、0.648;均为P<0.05)。结论 HMGB1和TLR4与气道炎症和免疫紊乱有关;适量1,25-(OH)2D3可减轻气道炎症,可能与调节Th1/Th2细胞平衡有关。     

黄芩苷对人牙周膜细胞RANKL-OPG表达的影响及其作用机制

目的 研究黄芩苷对人牙周膜细胞核因子-κB受体激活物配基和骨保护素(RANKL-OPG)表达的影响及其作用机制.方法 首先构建转化生长因子βⅡ型受体(TGF-βⅡR)靶向siRNA真核表达载体,转染正常人外周血T细胞,使T细胞表面的TGF-βⅡR基因沉默,继而将转染与未转染靶向性TGF-βⅡR基因沉默的T细胞和正常人牙周膜成纤维细胞置于加有黄芩苷和内毒素的培养基中,分为6组:①正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+转染siRNA1的T细胞+黄芩苷;②正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+转染siRNA1的T细胞;③正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+正常T细胞+黄芩苷;④正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+正常T细胞;⑤正常牙周膜成纤维细胞+黄芩苷;⑥正常牙周膜成纤维细胞.共培养48h,RT-PCR检测牙周膜细胞RANKL和OPG的表达,计算RANKL/OPG比值.结果 ①酶切鉴定正确的克隆测序结果与设计的目的 序列完全一致;②转染siRNA1的T细胞组的TGF-βⅡR mRNA的表达被明显抑制;③RANKL/OPG的比值在各组间的差异有统计学意义(P<0.01).结论 成功构建了TGF-βⅡR靶向siRNA真核表达载体并成功转染T细胞;黄芩苷可以降低牙周膜细胞表面RANKL/OPG比值;TGF-β的信号传导在黄芩苷影响牙周膜成纤维细胞表面的RANKL/OPG表达过程中起着重要作用;黄芩苷并非只通过TGF-β信号传导通路,而是亦通过其他通路对牙周膜成纤维细胞表面的RANKL/OPG进行调控.     

肠道菌群失调对内脏敏感性的影响及其机制

目的检测肠道菌群失调大鼠的内脏敏感性变化及紧密连接蛋白(ZO-1)、Toll样4受体(TLR4)的表达,探讨肠道菌群失调对内脏敏感性的影响及其机制。方法 SPF级SD大鼠30只,随机分为正常对照组(12只)、菌群失调组(18只)。菌群失调组采用盐酸林可霉素(300mg/mL)灌胃,1mL/(次·只),1次/d,连续给药7d;正常对照组采用等量生理盐水灌胃。第8天随机抽取菌群失调组和正常对照组大鼠各6只,检测模型是否成功。模型建立成功后,将其余12只菌群失调组大鼠随机分组:阴性对照组、益生菌干预组,每组6只。益生菌干预组给予双歧杆菌三联活菌胶囊(培菲康)灌胃,1粒/3mL生理盐水,1mL/(次·只),1次/d,连续给药7d;阴性对照组给予同等量生理盐水灌胃。第8天进行粪便菌群培养、检测内脏敏感性、检测结肠组织中ZO-1及TLR4的mRNA和蛋白表达、检测血清中炎性因子IL-10、TNFα的表达。结果与正常对照组比较,菌群失调组大鼠结肠ZO-1的mRNA含量及蛋白表达显著降低,而结肠TLR4的含量及蛋白表达显著升高,且血清中促炎因子TNFα表达显著升高,而抑炎因子IL-10的表达显著降低(P<0.05)。与菌群失调组相比,益生菌干预组结肠ZO-1的mRNA含量及蛋白表达显著升高,而结肠TLR4的mRNA含量及蛋白表达显著降低,且血清中促炎因子TNFα表达显著降低而抑炎因子IL-10的表达显著升高(P<0.05)。结论通过抑制结肠中ZO-1的表达及升高TLR4的表达,进而导致慢性低度炎症的发生可能是肠道菌群失调导致内脏高敏感的作用机制之一,同时益生菌制剂可能通过恢复肠道菌群变化进而改善内脏高敏感。     

大鼠肝脏干细胞的胰十二指肠同源盒基因表达系的构建与初步鉴定

目的 建立大鼠肝脏干细胞的Pdx-1基因表达系.方法 逆行穿刺SD大鼠乳鼠肝脏门静脉,经胶原酶Ⅳ消化并分离肝脏干细胞;免疫组织化学鉴定大鼠肝脏干细胞标志物细胞角蛋白18/19、甲胎蛋白的表达;构建pEGFP-Pdx-1表达载体并酶切鉴定,用脂质体2000介导表达载体转染大鼠肝脏干细胞后,荧光显微镜观察GFP表达,免疫组织化学鉴定Pdx-1的表达.结果 肝脏门静脉逆行穿刺分离培养大鼠肝脏干细胞具有分裂增殖能力、角蛋白18/19、甲胎蛋白表达阳性;pEGFP-Pdx-1表达载体转染后的肝脏干细胞可表达绿色荧光蛋白报告基因和Pdx-1蛋白.结论 成功建立了大鼠肝脏干细胞Pdx-1表达系.     

人肾癌鸡胚模型的建立及其肿瘤生物学特性的研究

目的建立人肾癌鸡胚模型,探讨其形态及生物学特性。方法将肾癌细胞系RLC-310接种于鸡胚绒毛尿囊膜,观察影响肾癌鸡胚移植瘤成活的因素、移植瘤生长特性、形态学特征和生物学性状。结果成功建立了人肾癌鸡胚移植瘤模型;移植瘤易于生长并具有较强的血管诱导作用;光镜下移植瘤具有与人肾癌类似的组织结构。结论该模型容易建立,能动态观察肾癌诱导血管生成的全过程,可用于肾癌的实验研究。     

ADAM10基因对肝癌细胞HepG2生物学特性的影响

目的探讨ADAM10基因对肝癌细胞HepG2增殖、侵袭、迁移等生物学特性的影响。方法采用RNA干扰的方法抑制肝癌细胞HepG2中ADAM10基因的表达,通过细胞增殖实验和集落形成实验检测该基因沉默前后肝癌细胞HepG2增殖等生物学特性的改变,通过细胞侵袭实验和细胞迁移实验检测HepG2侵袭、迁移等生物学特性的改变。结果 ADAM10基因沉默后细胞增殖能力下降(P<0.05);细胞体外侵袭能力、迁移能力显著下降(P<0.05)。结论 ADAM10基因表达变化参与原发性肝癌的发生、发展,ADAM10基因的高表达能促进肝癌细胞HepG2的增殖、侵袭和迁移能力。     

人甲状腺未分化癌鸡胚尿囊膜移植瘤模型的建立及生物学性状

目的建立人甲状腺未分化癌鸡胚尿囊膜(chick embryo chorioallantoic membrane,CAM)移植瘤模型,观察移植瘤的生长情况、组织形态及其与人甲状腺未分化癌组织形态的比较。方法收集本院2007²011年11例甲状腺未分化癌患者的肿瘤组织,进行HE染色并分析;将一定量的甲状腺未分化癌细胞株FRO接种于CAM上,观察鸡胚的存活情况和移植瘤的生长情况、形态学特征及生物学特征,并取移植瘤组织进行HE染色。结果 20μL含有6×106的甲状腺未分化癌细胞株FRO可在鸡胚尿囊膜上生长且不影响鸡胚的活力,移植瘤形态学特征与人甲状腺未分化癌组织的形态学特征相似。结论成功建立了人甲状腺未分化癌鸡胚尿囊膜移植瘤模型,为甲状腺未分化癌的进一步研究提供动物模型。     

Eukaryotic expression and biological activity analysis of neuroprotective peptide [Gly14]-Humanin

Objective To investigate the expression of neuroprotective peptide [Gly14]-Humanin (HNG) in eukaryotic cells by gene engineering technique and analyze its biological activity. Methods By means of asymmetrical primer/template, double stranded cDNA of HNG with FLAG in its C-terminal was obtained, which was cloned into the plasmid pcDNA3.1(-), and the resultant recombinant vector pcDNA3.1(-)/HNG-FLAG was transfected into PC12 cells. At the same time, the recombinant vector pcDNA3.1(-)/EGFP was transfected to control the efficiency of transfection. The expression of HNG in the cells was determined by immunocytochemistry. In order to analyze the biological activity of the expressed HNG, 25μM Aβ25-35 peptide was added to the culture medium of the transfected cells for 24h, then cell morphology, MTT assay and Hoechst 33258 staining were observed. Results The eukaryotic expression vector of pcDNA3.1(-)/HNG-FLAG was identified by enzyme digestion and sequencing. HNG was highly expressed in PC12 cells. After exposure of PC12 cells to 25μM Aβ25-35 for 24h, cell viability decreased to (65.8±5.3)%, and the dystrophic changes of neuritis and nuclei condensation were obvious. When cells were pre-transfected with pcDNA3.1(-)/HNG-FLAG, Aβ25-35-induced cell death and morphological changes of cells and nuclei were suppressed. In contrast, pre-transfected with empty vector did not protect cells from Aβ25-35-induced toxicity. Conclusion The eukaryotic expression vector for FLAG-tagged HNG was successfully constructed and expressed in PC12 cells. Expressed HNG has biological activity.     

尼美舒利对肝癌细胞增殖及Smad4表达的影响

目的观察选择性环氧化酶-2抑制剂尼美舒利对人肝癌细胞(HepG2)生长及Smad4蛋白表达的影响。方法 MTS法检测不同浓度尼美舒利(25、50、100、200、400μmol/L)作用于HepG2后,对照组和实验组HepG2细胞增殖的变化;TUNEL法检测尼美舒利对HepG2凋亡的影响;荧光显微镜观察尼美舒利干预后,肝癌细胞Smad4蛋白表达的变化。结果尼美舒利对肝癌细胞HepG2的增殖有抑制作用,且随着尼美舒利浓度的增高,其对HepG2增殖的抑制作用逐渐增强;同时可以促进肝癌细胞核固缩、碎裂,诱导其凋亡;尼美舒利干预组肝癌细胞Smad4蛋白的荧光标记量明显高于对照组。结论尼美舒利可以通过上调肝癌细胞Smad4蛋白的表达来抑制肝癌细胞的增殖、促进其凋亡。     

小分子RNA干扰人端粒酶逆转录酶对脑胶质瘤T98G细胞株生物学行为的影响

目的研究人端粒酶逆转录酶对胶质瘤细胞系体外生物学行为的影响,以期寻找控制胶质瘤细胞恶性行为的有效途径。方法应用小分子RNA干扰技术抑制T98G胶质瘤细胞系中端粒酶逆转录酶的表达,用MTT法、TUNEL法、Transwell分别检测T98G胶质瘤细胞中人端粒酶逆转录酶被抑制后对细胞体外增殖能力、细胞凋亡、细胞侵袭、迁移能力等生物学行为的影响。结果人端粒酶逆转录酶小分子RNA干扰片段能够有效抑制酶活性,抑制T98G胶质瘤细胞增殖(P<0.05)、诱导细胞凋亡(P<0.05)并抑制细胞的迁移与侵袭(P<0.05)。结论通过抑制人端粒酶逆转录酶的活性能够有效抑制胶质瘤细胞的体外恶性生物学行为,促进细胞凋亡。     

上调MiR-145的表达对口腔癌细胞CAL27生物学特性的影响

目的探讨MiR-145表达升高对口腔鳞状细胞癌细胞CAL27生物学特性的影响。方法通过实时定量PCR检测MiR-145在正常口腔黏膜细胞hNOK和口腔癌细胞CAL27的表达水平。通过MiR-145对CAL27的细胞转染,CAL27集落形成实验、细胞周期与凋亡实验,观察CAL27细胞生物学特性的改变。结果与正常口腔黏膜细胞hNOK相比,口腔癌细胞CAL27中的MiR-145表达呈下调状态。通过恢复口腔癌细胞中MiR-145的表达显著抑制了CAL27细胞集落的形成,并诱导G1期阻滞和细胞凋亡。结论 MiR-145可发挥口腔细胞癌的抑制功能,抑制口腔癌细胞CAL27细胞增殖特性,诱导其凋亡过程。在其诊断与治疗应用中,恢复MiR-145表达可能是一种合理的方法。     

5-Aza-CdR对人食管癌细胞株生物学行为及TFPI-2 mRNA表达的影响

目的探讨5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine,5-Aza-CdR)干预对食管鳞癌细胞株Eca9706生长增殖及其组织因子途径抑制物2(tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2)基因表达的影响。方法选取食管鳞癌细胞株Eca9706,并用不同浓度的5-Aza-CdR处理该细胞株。MTT法检测干预前后细胞增长率的变化,FCM法检测干预前后细胞凋亡率的变化,RT-PCR技术检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2基因mRNA的表达,免疫组化检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2蛋白的表达。结果食管鳞癌细胞株Eca9706存在TFPI-2基因超甲基化状态,经5-Aza-CdR处理后,超甲基化状态解除,细胞增殖受到抑制,细胞凋亡率明显提高(P<0.05);细胞中TFPI-2蛋白表达明显增强,同时mRNA的表达水平也较处理前明显提高(P<0.05)。结论食管癌细胞系TFPI-2基因超甲基化可抑制其mR-NA表达,当其超甲基化解除后,细胞增殖受到抑制,同时细胞凋亡率相应提高。     

基于生物信息学分析SOX12在口腔鳞状细胞癌中的表达及验证

目的通过生物信息学分析转录因子SOX12在口腔鳞状细胞癌(OSCC)中的表达,进一步探讨其与OSCC临床病理特征的关系,阐明SOX12对OSCC早期诊断及预后的影响。方法运用GEPIA数据库结合TCGA数据库分析SOX12在OSCC组织中的表达水平,并通过qRT-PCR进行体外验证;利用LinkedOmics数据库描述SOX12表达与OSCC临床病理学参数的相关性及对预后的影响;从String-DB数据库中分析SOX12在信号转导中的位置及与其关系密切的上下游基因。结果 SOX12在OSCC中呈高表达,且与OSCC病理分级、T分期、N分期呈正相关;TCGA分析显示,SOX12的表达与OSCC患者术后总体生存率有关;与SOX12相互作用的蛋白有POU3F1、POU3F2、POU3F3、MYT1L、NRSN2等,主要参与神经元的分化和发育等功能。结论 SOX12在OSCC中呈高表达,并与OSCC多个病理性指标相关。