MDM2/p53通路对多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞凋亡的调控

目的研究MDM2/p53通路对多发性骨髓瘤(MM)细胞凋亡的调控作用及机制。方法体外培养人MM细胞株(RPMI 8226)并分为实验组(Nutlin-3a)和对照组(药物溶剂),采用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况和抑制率,Western blot检测凋亡相关蛋白表达,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果与对照组相比,24、48、72 h时间点实验组细胞增殖明显降低,抑制率明显增高(P<0.05);实验组MDM2和Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05),而p53的表达水平明显升高(P<0.05)。实验组各时间点凋亡率(38.42%、82.26%、82.74%)均明显高于对照组(4.80%、8.06%、14.69%)。结论 MDM2与p53之间构成降解-反式激活循环通路影响下游凋亡相关蛋白Bcl-2的表达,抑制MM细胞的增殖,促进MM细胞凋亡。     

膀胱移行细胞癌多药耐药蛋白P-gp170的表达及意义

目的　研究膀胱移行细胞癌的多药耐药性。方法　应用免疫组织化学方法检测 80例膀胱移行细胞癌和 2 0例正常膀胱粘膜组织中P gp1 70的表达。结果　 80例膀胱移行细胞癌组织P gp1 70的表达阳性率为 42 % ,明显高于正常膀胱粘膜组织 ;化疗后复发肿瘤P gp1 70阳性表达率明显高于初发肿瘤。结论　P gp1 70介导的多药耐药是膀胱癌腔内灌注化疗失败的重要原因。     

髓样细胞白血病-1基因在多发性骨髓瘤发病中的分子机制

目的通过检测骨髓瘤细胞中依赖IL-6与否的髓样细胞白血病-1(mcl-1)基因的表达,阐明mcl-1基因在多发性骨髓瘤发病中的信号转导通路。方法应用JAK特异性抑制剂AG490、蛋白激酶抑制剂LY294002、ERK1/2信号通路的特异性阻断剂PD98059,分别研究了JAK/STAT通路、ras/MAPK通路及PI3K/Akt三大信号途径与mcl-1基因在多发性骨髓瘤中的关系。结果在骨髓瘤细胞8226和U266中,抑制ERK1/2活性不能改变mcl-1的表达;高浓度的AG490不能抑制STAT3的酪氨酸磷酸化;LY294002可抑制8226细胞和ANBL-6细胞的增殖,但不抑制mcl-1的表达。结论 Ras/MAPK通路以及PI3K通路在mcl-1基因的调节中无作用,但STAT的作用仍然需要进一步探讨。     

PML生长抑制因子在膀胱癌组织中的表达及意义

目的　探讨早幼粒细胞性白血病基因 (PML)与膀胱癌发生、发展的关系。方法　应用免疫组织化学方法检测 74例膀胱移行细胞癌组织中PML的表达。结果　在膀胱移行细胞癌中PML的表达随病理分级的上升而降低(P <0 0 5 ) ,随肿瘤侵入肌层而降低 (P <0 0 5 )。结论　PML表达与膀胱移行细胞癌的分级及肿瘤侵入肌层相关。     

蜂斗菜素诱导骨髓瘤RPMI 8226细胞凋亡及其机制

目的观察蜂斗菜素对骨髓瘤RPMI 8226细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法采用锥虫蓝拒染法检测蜂斗菜素对RPMI 8226细胞的增殖抑制作用,TUNEL法检测蜂斗菜素诱导的RPMIS226细胞凋亡,Hochest33258荧光染色法观察细胞核的变化,Western blot技术检测Caspase-3、8、9蛋白表达和MEK/ERK、p38MAPK蛋白磷酸化水平。结果蜂斗菜素作用24、48、72h后对骨髓瘤RPMI 8226细胞均有显著的增殖抑制作用(P均<0.01);蜂斗菜素呈时间和浓度依赖地诱导骨髓瘤RPMI 8226细胞凋亡(P<0.05,P<0.05),Caspase抑制剂预处理可明显抑制细胞凋亡;蜂斗菜素作用72h后,Caspase-3、8、9蛋白表达显著增加(P<0.05,P<0.01,P<0.05),ERK1/2及MEK蛋白磷酸化水平显著下降(P<0.01,P<0.05),p38MAPK蛋白磷酸化水平显著上升(P<0.01)。结论蜂斗菜素能够抑制骨髓瘤RPMI 8226细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能与Caspase-3、8、9蛋白激活,ERK/MEK及p38MAPK蛋白磷酸化改变有关。     

前列腺上皮内瘤中微血管密度、DNA倍体、免疫表型与其生物学特性的关系

目的 探讨微血管密度(MVD)、DNA倍体、免疫表型与前列腺上皮内瘤(PIN)及其生物学特性的关系.方法 应用免疫组织化学SP法和计算机图像分析技术,对24例前列腺增生症(BPH)、23例低级别上皮内瘤(LGPIN)、26例前列腺癌(PC)伴发高级别上皮内瘤(HGPIN)的石蜡包埋标本进行CD34、34βE12、P63、P504s表达的检测,定量测定其MVD和细胞核DNA倍体.结果 不同级别的PIN中MVD和DNA平均倍体均明显高于BPH组,但明显低于PC组(P<0.01),且随PIN级别的增高,DNA倍体的异多倍体数及MVD值随之升高(P<0.01).DNA倍体与MVD呈正相关关系.34βEl2和P63在BPH和LGPIN腺体周围的基底细胞呈连续阳性,在HGPIN中呈断续阳性,在PC中呈阴性.P504s在HGPIN中呈灶状阳性,在PC中呈强阳性,在BPH和LGPIN中呈阴性.结论 DNA倍体、MVD与PIN密切相关,是反映其生物学特性的重要参考指标;免疫表型进一步证实PIN特别是HGPIN是PC的癌前病变.     

黄芪甲苷改善高糖诱导的足细胞损伤和线粒体功能障碍并抑制Notch通路激活

目的 研究黄芪甲苷对高糖诱导足细胞损伤和线粒体功能障碍的保护作用及其分子机制。方法 构建高糖(30 mmol/L葡萄糖)诱导足细胞损伤模型,分别用低、中、高剂量黄芪甲苷与高糖共处理细胞;CCK-8检测细胞活性,TUNEL染色检测细胞凋亡,JC-1荧光探针检测线粒体膜电位,试剂盒检测ATP含量,Western blotting检测凋亡及足细胞损伤相关蛋白和Notch通路相关蛋白表达水平。结果 与control组相比,HG组细胞活性降低、细胞凋亡水平增加(P<0.05),抗凋亡蛋白(Bcl2)表达降低,凋亡蛋白(Bax、cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3)表达升高(P均<0.05);和HG组相比,HG+AS-IV组改善高糖诱导的细胞活性和细胞凋亡水平(P<0.05),抗凋亡蛋白(Bcl2)表达升高,凋亡蛋白(Bax、cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3)表达降低(P均<0.05);和control组比较,HG组细胞线粒体发生功能障碍,JC-1单体含量升高,ATP含量降低(P均<0.05);和...     

HBV preS1蛋白及ASGPR的亚细胞定位及其在肝组织中的分布

目的检测HBV preS1蛋白及ASGPR的亚细胞定位及在肝组织中的分布情况,为研究二者的生物学功能提供依据。方法激光共聚焦显微镜检测HBV preS1蛋白及ASGPR在HepG2细胞中的亚细胞定位情况以及二者是否存在共定位;免疫组织化学技术检测HBV preS1蛋白和ASGPR在肝组织中的表达情况。结果激光共聚焦显微镜下观察,在HepG2细胞的胞膜、胞质及胞核中均可见明亮的绿色荧光,表明HBV preS1蛋白弥散分布于肝细胞的胞膜、胞质及胞核中;在胞膜上可见明亮的红色荧光,而胞质中的红色荧光较弱,表明ASGPR主要表达于肝细胞膜上,在肝细胞质中呈弱表达。提示在HepG2细胞的细胞膜上HBV preS1蛋白与ASGPR具有共定位。在乙肝肝硬化患者的肝组织中,HBV preS1蛋白在肝细胞的胞膜、胞质及胞核中均有阳性表达;ASGPR不仅在肝细胞膜上有阳性表达,在胞质中的表达率也较高。此外,ASGPR在肝组织中的分布形式与HBV preS1蛋白无明显差异(P>0.05),并且二者的表达水平呈显著正相关(Pearson相关系数0.776,P<0.000 1)。结论 ASGPR除介导HBV入侵外,可能还参与了病毒的分泌及胞内运输等其他生命活动。     

肿瘤抑制因子DACT2在神经胶质瘤细胞上皮间质转化中的作用机制

目的探讨肿瘤抑制因子β-连环蛋白抑制基因2(DACT2)对神经胶质瘤细胞上皮间质转化的影响及潜在机制。方法以神经胶质瘤细胞U87、U251、A172和SHG44为研究对象,5-Aza处理后RT-PCR检测细胞中DACT2基因表达,甲基化特异PCR法(MSP)检测细胞中DACT2启动子甲基化状态,Western blot检测细胞中DACT2蛋白表达;构建过表达DACT2的U87细胞株,并用Western blot进行验证。Transwell实验检测细胞迁移侵袭能力,Western blot检测细胞中上皮间质标记物E-cadherin、Vimentin、MMP2及Wnt/β-cadherin通路蛋白active-β-cadherin、p-β-cadherin和totalβ-cadherin的表达变化。结果 5-Aza处理后4株细胞中均观察到DACT2基因表达,而未处理的U87和U251细胞中无DACT2基因表达,A172和SHG44细胞中DACT2有微弱表达。U87和U251细胞中DACT2启动子区完全甲基化,而A172和SHG44细胞中部分甲基化。U87和U251细胞中DACT2蛋白和mRNA表达低于A172和SHG44细胞(P<0.05)。转染pcDNA3.1-DACT2载体后,U87细胞中DACT2表达显著增加(P<0.05),过表达DACT2的U87细胞构建成功。过表达DACT2能抑制U87细胞上皮间质转化、侵袭迁移并阻断Wnt/β-catenin通路激活(P<0.05)。结论神经胶质瘤细胞中DACT2启动子呈高度甲基化状态,外源过表达DACT2能够促进胶质瘤细胞U87上皮间质转化和侵袭迁移,其机制可能与DACT2调控Wnt/β-catenin信号通路有关。     

USP39抑制肿瘤细胞放射敏感性的机制

目的探讨泛素特异性肽酶39(ubiquitin-specific peptidase 39, USP39)对肿瘤细胞DNA损伤应答通路的生物学作用。方法将不同肿瘤细胞系(293T, HeLa, U2OS, T47D)分别在含有100 mL/L FBS的DMEM或RPMI-1640培养基中,在37℃含有50 mL/L CO_2的培养箱中培养;用MTS[3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-etrazolium, inner salt]方法检测敲低USP39对肿瘤细胞放射敏感性的影响;流式细胞术检测同源重组(homologous recombination, HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)修复效率;Western blot检测敲低USP39对DNA损伤应答相关分子的表达情况;用免疫共沉淀、蛋白纯化及质谱技术,检测与USP39相互作用的蛋白并且进行基因本体论(gene ontology, GO)分析;通过微辐射诱导DNA损伤并利用激光共聚焦显微镜检测其募集至DNA损伤位点的情况。结果敲低USP39导致肿瘤细胞的放射敏感性显著增加(P<0.05);敲低USP39显著抑制肿瘤细胞的HR与NHEJ修复效率(P<0.05);敲低USP39能够促进DNA损伤应答因子蛋白的表达;USP39能够聚集至DNA损伤位点;USP39相互作用蛋白与多个DNA损伤应答相关的信号通路有关。结论 USP39对DNA损伤应答过程具有重要作用。     

The cloning and expression of renalase and the preparation of its monoclonal antibody

To obtain the recombination protein of renalase and prepare the monoclonal antibody, the human renalase gene was amplified from human kidney by specific primer and cloned the DNA fragments into the pET22b. After verification of the positive clones, the gene was transformed to E. coli BL21 to express the protein with 6His on C terminal. The Balb/c mouse was immunized with the purified protein to prepare the monoclonal antibody by hybidoma technique. The renalase protein was reconstructed and 2 strains of the hybidoma which can stable secrete renalase were obtained. The monoclonal antibody can both react with the both recombinant and human serum renalase. Foundation item: the Scientific Research Project of Shanghai Municipal Health Bureau (2008Y034), and the Natural Scientific Research Project of Shanghai (05ZR14086)     

单纯疱疹病毒2型gG-2"独特区"基因的原核表达及其血清学诊断价值

目的在大肠杆菌中表达HSV-2的gG-2"独特区"基因(gG-2T)并对其免疫学特性进行初步研究。方法克隆HSV-2的gG-2T,并在大肠杆菌中表达gG-2T融合蛋白。通过Western blot和间接ELISA鉴定融合蛋白的活性。结果通过原核系统表达的gG-2T融合蛋白可以与GST多克隆抗体结合并在46 ku附近出现特异性结合条带。并且能够与确诊的HSV-2患者血清反应,而不与HSV-1患者血清和正常人血清反应。结论获得了HSV-2 gG-2T融合蛋白,它可以与GST多克隆抗体特异性结合并且可以同HSV-2型患者血清特异性反应;获得的gG-2T蛋白为研究以gG-2蛋白作为靶区域的诊断试剂盒和疫苗研发打下实验基础。     

迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因的构建、表达及鉴定

目的 构建、表达及鉴定迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因.方法 采用RT-PCR方法从分泌迟缓爱德华菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1E11)中克隆出V_H和V_L可变区基因, 再通过重叠延伸拼接PCR方法在V_H和V_L可变区基因之间引入连接肽(Gly_4ser)_3,体外构建单链抗体基因;将其克隆至表达载体pET-28a并在大肠杆菌中表达,表达产物纯化后,用SDS- PAGE、Western blot及ELASA进行鉴定.结果 迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv在BL21(DE3)菌中获得表达,表达产物以不溶性包涵体形式存在,经过溶解包涵体、纯化和体外复性,获得了高纯度的单链抗体片段,重组蛋白的分子质量为27 ku.ELASA分析结果证实迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv与原代抗体一样,具有较高的抗原亲和力.结论 成功构建了迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv,为进一步制备迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗奠定基础.     

猪鼻支原体P40蛋白在肾癌组织中的表达及意义

目的检测猪鼻支原体P40蛋白在肾癌组织中的表达,探讨支原体感染与肾癌发生的关系。方法选取本院肾癌石蜡包埋标本95例,以远离肾癌的正常肾组织标本60例为对照,采用免疫组织化学方法检测肾组织中猪鼻支原体P40蛋白的表达情况。结果肾癌组织中猪鼻支原体P40蛋白阳性表达率为64.2%(61/95);癌旁正常肾组织的阳性表达率为21.7%(13/60),两者相比差异具有显著统计学意义(P<0.001)。结论肾癌的发生与支原体感染有一定的相关性,支原体感染可能是肾癌的生物学致病因素。     

THE EUKARYOTIC EXPRESSION OF HUMAN PERFORIN PROTEIN AND THE ESTABLISHMENT OF HYBRIDOMAS PRODUCING ANTI-HUMAN PERFORIN PROTEIN

Perforin is expressed mainly in activated cyto-toxic T lymphocytes (CTLs ) and natural killer(NK) cells. The human perforin gene has beencloned. The full length of its cDNA is l668bp, andthe mature HP protein is made up of 534 aminoacid residues with a molecular weight of 66Kd~75Kd. In CTLs and NK cells, perforin is stored incytoplasmic granules and is a major effector of cy-tolysis by these cells. Upon granules releasing,perforin monomers insert into the plasma mem-branes of target ce…     

哇巴因多克隆抗体对两肾一夹肾血管性高血压大鼠血流动力学的影响

为探讨哇巴因多克隆抗体的降压作用及哇巴因与高血压发病的关系 ,给“两肾一夹 +盐 ( 2 k1 c+盐 )”、“两肾一夹 ( 2 k1 c)”肾血管性高血压大鼠随机静注哇巴因多克隆抗体、硝普钠、正常兔免疫球蛋白 ( Ig G)及生理盐水 ,颈动脉插管观察注射后 3h内血压动态变化。结果表明 :哇巴因多克隆抗体对“两肾一夹 +盐”肾血管型高血压大鼠具有明显的降压作用 ,而对“两肾一夹”高血压模型降压作用不明显。正常兔免疫球蛋白对各种高血压模型均无降压作用。提示内源性哇巴因 ( EO)升高可能是高血压的发病因素之一 ;高盐引起血压升高的机制之一可能是通过刺激 EO的分泌增加。     

抗人γ-精浆蛋白V_H单域抗体基因的构建、表达及空间构象分析

目的　扩增出抗人γ 精浆蛋白 (γ Sm)单克隆抗体 (mAb)的重链可变区 (VH)单域抗体基因 ,并进行原核表达及空间构象分析。方法　从分泌抗γ SmmAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA ,经RT PCR扩增VH 单域抗体基因 ,将其克隆到融合蛋白表达载体 pGEX 4T 1中进行表达 ,并利用计算机软件对表达产物进行空间构象分析。结果　VH 单域抗体基因全长 363bp ,含起始码和终止码。将其克隆到 pGEX 4T 1内 ,转化大肠杆菌DH5α ,获得高效表达 ,表达量占全菌总蛋白质的 38% ,以包涵体形式存在。经初步纯化和复性后 ,用谷胱甘肽 (GST)亲和色谱纯化 ,再经凝血酶水解获得抗γ SmVH 单域抗体。竞争结合抑制实验证明 ,该表达产物具有前列腺癌细胞亲和活性。空间构象分析结果显示 ,该抗体具有完整的抗原结合位点。结论　构建成功抗γ Sm的VH 单域抗体 ,为进一步临床应用奠定基础。     

IgM抗体捕获ELISA法对流行性出血热患者尿液中特异性IgM抗体的检测

将IgM抗体捕获ELISA法应用于检测流行性出血热病人尿液中的特异性IgM抗体,总阳性率72.62%,7～9病日可达83.87%;第3病日即可出现阳性;并且具有较高的特异性和敏感性。尿中特异性IgM抗体检出的阳性率与病日(G=7.3858,P>0.05)及尿蛋白含量(G=4.4003,P>0.05)间均无明显关系;特异性IgM抗体的滴度与病日有关(F′=26.5331,P<0.01)与尿蛋白含量无明显关系(F=2.2074,P>0.05);不同病日尿液中特异性IgM抗体检出的阳性率与滴度呈正相关(r=0.9973,P<0.01)。     

MAPPING EPITOPES OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 16 L1 PROTEIN WITH A PHAGE DISPLAY EPITOPE LIBRARY

Theinfectionofhumanpapillomavirus(HPV)isakindofcommonsexuallytransmitteddiseases.Thehigh-riskgroupHPV,especiallyHPV16iscolselyassociatedwithhumancervicalcancer,anditwasindicatedasaninitiationfactorofcervicalcancertl].HPV16FIgenelocatedinlateopenreadingframesoftheviralgenomeencodesthemajorcoatprotein,LIprotein,whichcouldassembleintoviruslikeparticles(VLP)aloneintheinfectiousnucleit23.AbatchofevidencesshowedthattheLIproteincouldinduceantibodieswithhightiterinthehostandtheantibodiesmightp…     

真核表达人乳头瘤病毒16型L_1蛋白在检测宫颈癌患者相应抗体的应用

用真核表达HPV16L1蛋白为抗原，酶联免疫吸附测定64例宫颈癌患者血清和阴道分泌物的相应抗体，并用型特异性聚合酶键反应检测宫颈癌组织HPV16L1基因。结果：宫颈癌组血清HPV16L1抗体阳性年64．1％，对照组20．8％；宫颈癌组阴道分泌物HPV16L1抗体阳性率64.1％，对照组25％；宫颈癌组HPV16L1基因检出率为42．2％，对照组10％。有显著差异（P＜0．01）。结论：高危型HPV感染，宫颈癌患者有明显免疫反应，全身和局部无明显差异，真核表达HPV16L1蛋白可用于宫颈癌患者的抗体测定。