外排系统与膜通透性的改变对淋球菌高水平多重耐药的影响

目的 探讨外排系统与膜通透性的改变对淋球菌多重耐药的影响.方法 PCR扩增淋球菌mtrR启动子区域包含13 bp回文序列在内的157个碱基片段并进行DNA测序分析;提取外膜蛋白,利用SDS-PAGE进行组成型的分析.结果 5株敏感株的mtrR启动子区域未发生突变,3株高水平多重耐药株的mtrR启动子区域13 bp回文序列均发生了单个A/T碱基的缺失,且均存在外膜孔蛋白表达的缺失.结论 mtrR启动子区域13 bp回文序列单个A/T碱基的缺失引起的mtrCDE外排泵表达增加与外膜孔蛋白表达的缺失或下降导致的膜通透性降低,在介导淋球菌产生高水平多重耐药中起一定的作用.     

头孢西丁耐药的葡萄球菌mecA基因检测及耐药性分析

目的对头孢西丁纸片扩散法检测耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)的可靠性进行评价,并分析头孢西丁耐药的葡萄球菌即MRS感染及耐药性情况,以指导临床合理用药。方法临床分离葡萄球菌310株,以PCR检测葡萄球菌mecA基因为判断MRS的标准,按美国国家临床实验室标准化研究所(CLSI/NCCLS)标准操作规程进行头孢西丁、苯唑西林纸片扩散法(K-B法)药敏试验检测MRS,同时检测MRS及甲氧西林敏感葡萄球菌(MSS)对10种常用抗生素的耐药性。结果在310株葡萄球菌中金黄色葡萄球菌198株,凝固酶阴性葡萄球菌112株,经mecA基因检测,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)为57.1%(113/198),耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)为62.5%(70/112);头孢西丁纸片扩散法检测MRSA的敏感性和特异性均为100%,检测MRCNS敏感性为98.6%,特异性为100%;除复方新诺明和万古霉素外,MRS对其余8种抗生素的耐药率明显高于MSS,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论头孢西丁纸片扩散法操作简便,结果可靠,可作为临床实验室检测MRS的常规方法;MRS的感染发生率及耐药性较高,且对各类抗生素多重耐药,需加强其耐药性监测。     

CD40基因多态性与自身免疫性甲状腺病的相关性

目的了解CD40基因多态性在西北地区汉族人群中的分布及其与自身免疫性甲状腺病(AITD)的相关性。方法随机选取本院内分泌科门诊的165例Graves病(GD)患者、113例桥本甲状腺炎(HT)患者为研究对象,以94例健康体查者为对照。①应用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性技术检测CD40基因5′非翻译区-1位点C/T多态性(5′UTR C(-1)T)、第三外显子58038位点-/T多态性;②应用扩增受阻突变系统-聚合酶链反应检测第九外显子64610位点C/G多态性。结果①5′UTR C(-1)T位点中CC基因型、C等位基因在GD组和对照组间有显著差异(P<0.05);②58038位点在372例样本中均为TT型;③64610位点未发现GG基因型。结论①西北地区汉族人CD40基因5′UTR C(-1)T位点上C等位基因型与GD发病有相关性,CC基因型者患GD的危险性较TT高;②58038位点-/T在西北地区汉族人中无多态性;③64610位点C/G在西北地区汉族人中未发现GG基因型。     

外泌体在体外对乳腺癌细胞耐药信息传递的作用

目的探讨外泌体(exosomes,EXOs)在乳腺癌细胞间耐药信息的传递作用。方法选用乳腺癌敏感细胞株(MCF-7)及其阿霉素耐药株(MCF-7/ADR)为模型,用超速离心法提取MCF-7/ADR外泌体(ADR/EXO);用透射电子显微镜观察鉴定细胞外泌体形态;运用倒置荧光显微镜观察ADR/EXO与MCF-7细胞的相互作用过程;运用激光共聚焦显微镜观察MCF-7与MCF-7/ADR在Transwell小室共培养60h后细胞内阿霉素药物浓度变化;运用CCK-8法检测ADR/EXO与MCF-7细胞共培养后对阿霉素的IC50的影响;运用RT-PCR检测MCF-7与ADR/EXO共培养后MDR1基因表达水平的变化;运用Western blot法检测MCF-7与ADR/EXO共培养12h和72h后P-gp表达水平的变化。结果透射电子显微镜下,外泌体呈现典型的圆形或椭圆形杯口状结构,直径为40~100nm;用PKH67标记ADR/EXO显示,ADR/EXO是可以被MCF-7细胞摄取;与ADR/EXO共培养后敏感细胞株MCF-7对阿霉素的IC50耐药性升高2.62倍,差异有统计学意义(P<0.05);经过与MCF-7/ADR在Transwell小室中共培养60h后的MCF-7细胞,胞内可见阿霉素聚集减少,核区分布减少,荧光强度减弱;MCF-7+ADR/EXO组MDR1的mRNA表达量明显增加,是MCF-7组的8.69倍,差异有统计学意义(P<0.05);与MCF-7组相比,共培养12h的MCF-7+ADR/EXO组P-gp相对表达量升高4.64倍,差异有统计学意义(P<0.05);与MCF-7组相比,共培养72h的MCF-7+ADR/EXO组P-gp相对表达量升高3.37倍,差异有统计学意义(P<0.05)。结论乳腺癌外泌体可能具有传递耐药信息的作用,耐药细胞外泌体能够使敏感细胞获得一定的耐药性,耐药细胞外泌体向敏感细胞传递P-gp,不仅可以通过蛋白形式进行传递,而且可以通过mRNA的形式进行传递。     

脐血胰岛素样生长因子-2和印记基因H19与胎儿生长受限的关系

目的探讨脐血胰岛素样生长因子-2(IGF-2)和H19印记状态与胎儿生长受限(FGR)的关系。方法采用放射免疫法测定42例FGR孕妇(研究组)和晚期正常妊娠妇女30例(对照组)脐血中IGF-2水平,同时采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术,检测胎盘组织中H19基因印记状态。结果①研究组脐血IGF-2水平为(1.52±0.20)μg/L,明显低于对照组的(1.97±0.21)μg/L(P<0.05)。②研究组中杂合子20例,其中9例双等位基因表达;对照组中杂合子14例,均为单等位基因表达;研究组H19基因印记丢失明显高于对照组(P<0.05)。③研究组H19双等位基因表达的病例脐血IGF-2水平均明显低于H19杂合性丢失和H19单等位基因表达病例(P<0.05);H19杂合性丢失和H19单等位基因表达病例脐血IGF-2水平无显著性差异。结论妊娠晚期IGF-2减低是导致FGR发生的原因之一;H19基因印记丢失下调IGF-2基因间接影响胎儿生长发育。     

PPAR-γ2基因Pro12Ala多态性不能预测罗格列酮改善PCOS患者的卵巢生殖功能

目的探讨多囊卵巢综合征(PCOS)患者过氧化物酶增殖物激活受体-γ2(PPAR-γ2)基因Pro12Ala多态性与罗格列酮疗效的关系。方法选择本院生殖内分泌门诊150例PCOS患者,检测血清性激素水平、葡萄糖耐量试验(OGTT)、胰岛素释放试验(IRT)。135名月经周期规律的正常女性为对照组。PCOS组分为胰岛素抵抗(IR)组和非IR(NIR)组,IR组46例口服罗格列酮4mg,1次/d,共12周,3月后复测上述化验。采用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法检测两组受试者PPAR-γ2基因Pro12Ala多态性。结果①PCOS组和对照组脯氨酸/丙氨酸(P/A)型频率分别为6.7%和5.9%(P>0.05),丙氨酸(Ala)等位基因频率分别为3.3%和3.0%(P>0.05);②PCOS组睾酮(T)水平与空腹胰岛素呈正相关(r=0.69,P<0.01);T与PPAR-γ2 Pro12Ala变异频率呈负相关(r=-0.91,P<0.05),PCOS-P/A组T水平小于脯氨酸/脯氨酸(P/P)组(2.24±1.14,2.58±0.83nmol/L,P<0.05);③罗格列酮组(46例)均是P/P型基因,用药后,27例排卵(58.70%),12人妊娠(26.10%),胰岛素敏感指数(ISI)升高(0.02±0.01,0.03±0.01,P<0.05),T浓度下降(3.56±0.45,2.21±0.63,P<0.05)。结论①PPAR-γ2基因Pro12Ala突变的PCOS妇女雄激素水平低下,提示Ala等位基因是一个保护基因;②罗格列酮改善PCOS患者卵巢功能的临床疗效异质性与PPAR-γ2Pro12Ala多态性可能无直接关系。     

耐亚胺培南鲍曼不动杆菌的耐药性分析及金属β-内酰胺酶的检测

目的 了解我院鲍曼不动杆菌的耐药性及其产金属β-内酰胺酶(MBLs)的情况.方法 采用K-B纸片扩散法测定13种抗菌药物的耐药性;分别用金属螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)和2-巯基丙酸抑制试验测定鲍曼不动杆菌产金属β-内酰胺酶的情况.结果 91株鲍曼不动杆菌中有23株对亚胺培南耐药,其仅对阿米卡星和米诺环素耐药率较低,分别为21.7%和26.1%;对头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦和环丙沙星部分耐药,耐药率分别为52.2%、43.5%和65.2%;对头孢吡肟耐药率非常高(91.3%);对氨苄西林/舒巴坦、庆大霉素、头孢噻肟、头孢他啶、复方磺胺和美罗培南全部耐药;与亚胺培南敏感组比较,除阿米卡星、环丙沙星、米诺环素外,亚胺培南耐药组对其他抗生素的敏感率明显降低、耐药率明显增高(P<0.05).23株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌金属β-内酰胺酶的检出率为65.2%(15/23).结论 耐亚胺培南不动杆菌的耐药现象非常严重,临床应根据药敏结果合理选用抗生素; 金属β-内酰胺酶的产生是鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的重要机制之一,实验室应加强对产酶菌株的监测.     

紫杉醇诱导人肺腺癌多药耐药细胞系的建立及DNA polβ、mdr1、mrp1、GST-πl、rp和topo Ⅱ基因的表达

目的体外建立人肺腺癌细胞多药耐药细胞系,观察其生物学特性并探讨其细胞内DNA polβ和多药耐药基因mdr1、mrp1、GST-πl、rp和topo Ⅱ的表达及意义。方法以紫杉醇为诱导药,采用间歇逐步增加剂量法建立人肺腺癌多药耐药细胞系A549/TXL20;MTT法检测A549/TXL20对紫杉醇、顺铂、长春新碱、5-氟尿嘧啶和丝裂霉素的耐药指数(RF);细胞克隆形成法测定A549/TXL20对紫杉醇的敏感性;高效液相色谱测定细胞内紫杉醇的浓度;RT-PCR法测定人肺腺癌多药耐药细胞系A549/TXL20中DNA polβ、mdr1、GST-π、mrp1l、rp和topo Ⅱ的基因表达。结果①A549/TXL20形态不规则,较亲本细胞略小,核/浆比增加,倍增时间没有明显变化;②A549/TXL20对紫杉醇的RF为19.3,对顺铂的RF为67.4,对长春新碱、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素和顺铂等抗癌药物有不同程度的耐药性;③A549/TXL20对紫杉醇的敏感性降低,其紫杉醇的含量较亲本细胞下降;④A549/TXL20细胞中DNA polβ、mdr1、GST-π、mrp1l、rp的基因表达量分别较A549细胞中的表达量明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论建立了相对稳定的人肺腺癌多药耐药细胞系A549/TXL20,其耐药机制可能与mdr1、GST-π、mrp1l、rp和DNA polβ基因的高表达有关。     

屎肠球菌临床分离株的耐药性及生物膜形成与毒力因子的相关性分析

目的分析陕西地区屎肠球菌临床分离株的耐药性、生物膜及溶血性的相关性。方法收集西安市某大型三甲医院2017年5月-8月临床标本分离的174株屎肠球菌分离株。药敏法测定其耐药表型,结晶紫法测定其生物膜形成能力,并定量检测其溶血活性,多分类Logistic回归检验菌株多重耐药性、溶血活性及生物膜形成能力的关联。结果屎肠球菌对β-内酰胺类抗菌药物的耐药比例高于90%,只检出1株利奈唑胺耐药,未检出万古霉素耐药。女性患者标本的分离株对青霉素的耐药率高于男性(χ~2=4.925,P=0.027)。尿标本中屎肠球菌的分离率最高(67/38.5%),其分离株对喹诺酮类和β-内酰胺类、红霉素的耐药性显著高于非尿液标本(χ~2=6.578,P=0.010;χ~2=8.797,P=0.003;χ~2=9.533,P=0.002)。分离株的生物膜阳性率为66.7%(116/174),溶血阳性率为90.2%(157/174),对β-内酰胺类和喹诺酮类抗生素耐药的菌株中生物膜阳性率高于生物膜阴性率、溶血阳性率低于溶血阴性率。分离株的主要多重耐药谱型为左氧氟沙星、环丙沙星、青霉素、氨苄西林和红霉素多重耐药菌(72/41.4%),其中73.6%形成生物膜,该谱型耐药且形成生物膜的菌株中86.8%的菌株溶血阳性;多重耐药谱型为左氧氟沙星、环丙沙星、青霉素、氨苄西林、红霉素和四环素的多重耐药菌(62/35.6%),其中71.0%形成生物膜,该谱型耐药且形成生物膜的菌株中的95.5%溶血阳性。菌株的5重耐药性与溶血活性负向关联(RRR=0.46,P=0.030),与生物膜形成能力正向关联,但差异无统计学意义(RRR=1.984,P=0.051)。结论在屎肠球菌引起的感染,特别是泌尿系统感染的临床治疗中应避免经验使用β-内酰胺类、喹诺酮类及红霉素类抗生素,以降低生物膜形成,有效控制细菌耐药的产生和发展。     

非多重耐药及多重耐药鲍曼不动杆菌外排泵及其表达

目的探讨多重耐药鲍曼不动杆菌(multidrug resistant Acinetobacter baumannii,MDRAB)及非多重耐药鲍曼不动杆菌(non-multidrug resistant Acinetobacter baumannii,N-MDRAB)的外排泵表型、基因型和外排泵基因表达情况。方法应用K-B法将120株临床分离的鲍曼不动杆菌,分成MDRAB 96株和N-MDRAB 24株两组;参照Sylvia Valdezate方法检测鲍曼不动杆菌的外排泵表型,即采用微量肉汤稀释法,观察加入泵抑制剂羰基氰氯苯腙(CCCP)前后其MIC值的变化,筛选出加入泵抑制剂后MIC值比原值降低1/4倍或以上的菌株为AB外排泵表型阳性;PCR法扩增外排泵蛋白基因并测序进行序列分析。结果 96株MDRAB对β-内酰胺类、头孢菌素类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类、磺胺类、多黏菌素类抗菌药物的耐药率分别为76.04%~92.71%、73.96%~97.92%、40.63%~42.71%、92.71%~98.96%、93.75%~98.96%、98.96%、79.17%、0。24株N-MDRAB对头孢菌素类、β-内酰胺类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类、磺胺类、多黏菌素类抗菌药物的耐药率分别为16.52%~20.43%、11.22%~15.65%、0、17.83%~18.26%、20.43%~23.39%、14.78%、19.57%、0。外排泵抑制检测结果显示,96株MDRAB有34株外排泵阳性,外排泵基因检测有33株adeB、32株adeR、33株adeS、33株adeJ、0株adeE和33株abeM,检出阳性率分别为97.06%、94.12%、97.06%、97.06%、0、97.06%;24株N-MDRAB未检测到外排泵阳性菌株,但外排泵基因检测有12株adeB、20株adeR、16株adeS、18株adeJ、0株adeE和16株abeM,检出阳性率分别为50%、83.33%、66.67%、75%、0、66.67%。对adeB、adeR、adeS、adeJ、abeM基因进行测序,经比对,所测序列与GenBank中序列同源性为100%。结论外排泵基因广泛存在于MDRAB中,但在N-MDRAB中亦可以发现主动外排泵基因的存在。