RD-PCR技术在酵母基因表达谱研究中的应用

目的　应用RD PCR技术分离酵母基因。方法　首先提取酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)总RNA ,纯化mRNA ;然后 ,反转录成双链cDNA ;再用限制性内切酶Sau3AI酶切 ,在酶切片段上加上接头后 ,用通用引物U进行第一次PCR扩增 ,以这一产物为模板用选择性引物(在通用引物的 3’端延伸两个碱基 )作第二次PCR扩增。 5 %PAGE胶分离基因片段 ,选择单带割胶回收 ,做第三次PCR扩增 ,与载体连接 ,最后进行测序分析。结果　采用这种方法分离得到的基因片段 ,经Blast检索分析 ,确为来自酿酒酵母基因的cDNA片段或表达序列标签 (EST)。结论　RD PCR技术可以有效地分离EST ,可用于酵母基因表达调控的研究。     

SH-SY5Y细胞基因片段文库及其数据库的建立

目的　建立SH SY5Y细胞基因片段文库和一种对大量cDNA片段数据管理系统的方法。方法　采用RD PCR技术构建SH SY5Y细胞基因片段文库 ,并对每一个克隆进行测序。应用FOXPRO编制一个软件对其大量的信息进行系统化管理。结果　应用RD PCR技术建立了细胞的cDNA片段文库 ,由 12 0 0余个片段克隆组成 ;应用FOXPRO制作了基因片段数据信息管理系统的软件 ,对此文库片段的测序数据进行管理。结论　采用RD PCR技术是一个很好的建立基因片段文库的方法 ;建立了基因片段数据信息管理系统的软件进行这个文库数据的管理。     

聚合酶链反应早期诊断结核性关节炎的临床价值

目的　探讨聚合酶链反应 (PCR技术 )对诊断结核性关节炎的临床价值。方法　对 42例结核性关节炎与 2 0例非结核性关节炎的关节积液分别应用抗酸染色镜检 ,分离培养和PCR检测。结果　 42例结核性关节积液三种方法的检出率分别为 :镜检法 1 9 0 % ,培养法 38 1 % ,PCR法 66 7% ,后者显著高于前二者 (P <0 .0 1 )。 2 0例非结核性关节积液抗酸染色镜检和分离培养结果均为阴性 ,PCR阳性率 1 0 %。结论　PCR技术检测关节积液中的结核杆菌具有快速、敏感和高效等优点 ,对关节结核的早期诊断和鉴别诊断具有重要价值     

基于MPEG-2编码复用的恒定码率算法研究

本文采用一种简单算法,快速高效地完成了基本流(ES)复用成恒定码率的传输流(TS)。文章分析了基于MPEG-2传输流复用的两种现有技术,即基于节目参考时钟(PCR)包的码率控制和基于缓存器的码率控制;探讨了基本流(ES)复用成传输流(TS)的方法,给出了ES流复用成TS流的流程,研究了解码时间/显示时间(PTS/DTS)、节目参考时钟(PCR)包以及空包的计算方法,特别涉及一种基于TS复用的恒定码率控制方法的研究。     

牙龈卟啉菌蛋白酶rgp Acd基因表达载体的构建

目的构建牙龈卟啉菌蛋白酶rgpA催化结构域(rgpAcd)基因的表达载体。方法利用PCR技术和基因重组技术,克隆牙龈卟啉菌蛋白酶rgpAcd,插入中介载体pMD18-T中并测序鉴定。将目的基因片断插入原核表达载体pET-15b,构建表达质粒pET-15b/rgpAcd,通过限制性酶切鉴定。结果PCR产物电泳结果显示,在大约1.5 kb处有一特异的条带,与预期的大小一致,核酸序列测定与分析的结果表明,克隆的1 476 bp基因序列与GenBank数据库中的序列呈现100%同源性,未发生任何突变;构建的表达质粒经酶切后所得片断与预期大小一致,表明牙龈卟啉菌蛋白酶rgpAcd基因的表达载体构建成功。结论成功克隆了牙龈卟啉菌rgpAcd基因并构建了表达载体,为进一步研制重组活载体疫苗奠定了基础。     

膀胱癌中BLU基因启动子高甲基化和转录水平

目的研究膀胱癌中BLU基因启动子甲基化状态、转录水平及其意义。方法采用甲基化特异性PCR(meth-ylation specific PCR,MSP)技术和逆转录PCR(RT-PCR)技术分别检测54例膀胱癌患者癌组织及45例相应癌周正常组织、3例非肿瘤患者的正常膀胱组织中BLU基因启动子甲基化状态和转录水平。结果①31.5%(17/54)膀胱癌组织中BLU基因高甲基化,相应癌周正常组织和3例正常膀胱组织均未发现该基因高甲基化改变;②甲基化状态与膀胱癌临床病理参数无明显相关性;③在45例膀胱癌组织中,BLU表达缺失率为42.2%(19/45);④BLU mRNA表达缺失与肿瘤临床分期和病理分级相关(P<0.05);⑤在启动子高甲基化的膀胱癌中,92.3%(12/13)BLU mRNA表达异常下调或缺失。结论膀胱癌中频繁发生BLU基因的高甲基化和mRNA表达缺失,其高甲基化可能是基因转录失活的重要原因。     

人ECK基因外显子3的实验研究

目的　建立人eck基因外显子 3(exon 3)的克隆与鉴定方法 ,研究其在ZR 75 1细胞系中的突变情况。方法　设计一对eck基因exon 3特异性引物 ,提取人正常皮肤组织和乳腺癌细胞系ZR 75 1基因组DNA ,并以此作为模板 ,采用聚合酶链反应 (PCR)技术扩增eck基因exon 3片段 ,克隆入中介载体pUCm T中构建重组质粒 ,转化JM10 9大肠杆菌 ,扩增后经酶切、PCR初步鉴定后 ,进行序列分析。结果　①从正常皮肤组织上皮细胞、ZR 75 1细胞系基因组DNA中 ,经PCR扩增 ,获得了人eck基因exon 3片段 ;②建立了正常皮肤组织、ZR 75 1细胞系eck基因exon 3片段的克隆 ;③ZR 75 1细胞系中eck基因exon 3片段存在突变。结论　从人组织与细胞系基因组DNA中 ,成功地构建了人类eck基因exon 3的克隆 ,并证实eck基因exon 3在ZR 75 1乳腺癌细胞系中有突变 ,为进一步研究eck基因exon 3在肿瘤形成中的作用奠定了基础     

miR-125a-3p和miR-17-5p在激素性股骨头坏死中的作用

目的探讨激素性股骨头坏死中miRNA的差异性表达变化。方法取激素性股骨头坏死的坏死区域骨组织为实验组,其股骨颈基底部骨组织为对照组;分别提取总RNA并进行质检;采用miRNA芯片技术检测miRNAs的表达并对其表达谱进行分析;运用实时定量PCR对差异明显的miR-125a-3p和miR-17-5p进行验证。结果对激素性股骨头坏死中miRNA表达谱进行差异性分析。和对照组相比,实验组中倍数大于2倍,P<0.05的miRNA共有11个。8个miRNA表达上调,3个表达下调。实时定量PCR证实miR-125a-3p在坏死标本中高表达,而miR-17-5p呈现低表达,与miRNA芯片结果一致。结论激素性股骨头坏死区域骨组织与对照组相比miRNAs表达发生明显变化,以miR-125a-3p和miR-17-5p差异最为明显。这表明了它们最有可能参与了激素性股骨头坏死病理过程的调控。     

改良HCV RT-PCR方法及产物的SSCP分析

传统的RT－PCR方法，要对模板RNA进行提取和纯化，以除去RNA酶和其它杂质，而且要对可能存在的RNA酶进行抑制，防止模板RNA被降解[1]。而在PCR扩增时，用一对引物反转录和扩增的特异性并不高，因此大都采用套式PCR，以获得特异性好的PCR产物。这就使得实验成本增高，耗费时间，同时也给SSCP分析带来很大不便。因为在进行PCR产物的SSCP分析时，产物的特异性要高，即电泳条带要窄、要亮，这样SSCP分析结果才可靠”’。我们采用改良的SIOZ吸附法从血清中提取HCVRNA，并用一对引物对HCVRNAC区进行RT－PCR扩增，获得了…     

改良HCV RT-PCR方法及产物的SSCP分析

传统的RT－PCR方法，要对模板RNA进行提取和纯化，以除去RNA酶和其它杂质，而且要对可能存在的RNA酶进行抑制，防止模板RNA被降解[1]。而在PCR扩增时，用一对引物反转录和扩增的特异性并不高，因此大都采用套式PCR，以获得特异性好的PCR产物。这就使得实验成本增高，耗费时间，同时也给SSCP分析带来很大不便。因为在进行PCR产物的SSCP分析时，产物的特异性要高，即电泳条带要窄、要亮，这样SSCP分析结果才可靠”’。我们采用改良的SIOZ吸附法从血清中提取HCVRNA，并用一对引物对HCVRNAC区进行RT－PCR扩增，获得了…     

腹水TB-PCR对结核性腹膜炎的诊断价值

结核性腹膜炎是临床常见病之一，其中又以渗出型多见．近年其发病率有上升趋势。但临床上结核性腹膜炎的诊断缺乏特异性指标，常依赖于综合分析甚至治疗试验，对不典型病例的诊断常有困难，长期以来人们一直在探索快速、准确的诊断。聚合酶链反应（Polymerasechainreaction，PCR）是80年代开始发展起来的一种分子生物学技术，目前已逐渐应用于临床诊断。本文探讨了结核杆菌PCR（TB-PCR）对结核性渗出型腹膜炎的诊断价值，报告如下。资料与方法1病例选择及标本采集患者均为我院住院病人。结核性渗出型腹膜炎21例，男性11例，女性10例，…     

PCR-SSP法检测胎儿、新生儿ABO血型

目的　研究用PCR SSP法鉴定胎儿、新生儿血型及基因型。方法　用PCR SSP法检测 5 6例 16周以上孕妇的胎儿、新生儿脐血红细胞基因型 ;用常规法检测双亲及胎儿、新生儿血红细胞ABO血型。结果　用PCR SSP法检测出全部 5 6例脐血ABO血型及基因型 ;PCR SSP法检测出的子代血型与由父母血型按孟德尔遗传规律推测的子代血型符合率达 10 0 % ;用常规法检测脐血ABO血型 ,检出率为 87.5 %。结论　PCR SSP法检测子代ABO血型方法可靠 ,且可鉴定出其亚型     

应用抑制性消减杂交技术筛选NS5ABP37的反式调节基因

目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建NS5ABP37反式激活相关基因差异表达的cDNA文库,筛选NS5ABP37蛋白反式激活相关基因.方法 以表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ABP37转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,从转染后的细胞裂解液中提取mRNA并合成cDNA,经RsaⅠ酶切消化后将实验组cDNA分成两组,分别衔接两种不同接头,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR反应;第2次PCR产物与pGEM-T easy克隆载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR鉴定后进行测序及同源性分析.结果 成功构建了人NS5ABP37蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA文库.扩增后得到60个200～1000bp插入片段的克隆,随机挑选其中20个测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得9种已知功能编码基因.结论 NS5ABP37基因功能涉及细胞生长调节、信号转导和能量代谢.     

重组PCR——一种快速体外基因重组技术

重组PCR是一种用于体外进行基因重组的简单、高效、快速技术 ,在基因重组过程中 ,不受载体和待连接DNA片段内部自身酶切位点的制约 ,连接时不依赖于限制性内切酶和连接酶 ,具有传统的DNA重组技术无法比拟的优势。     

应用DNA PCR法扩增检测苯丙酮尿症基因突变

本文应用PCR和核酸杂交技术,在西安地区14例PKU患儿中检测了目前中国人中唯一确定引起PKU的PAH基因外显子3终止突变,结果发现这些患者的PAH基因均无终止突变,提示在我国有可能因PAH基因其它部位突变导致PKU的发生。我们体会DNA体外PCR扩增结合寡核苷酸探针点杂交方法可用于PKU的产前诊断和携带者检出。     

人乳头瘤病毒11型E6基因完整开放阅读框架的克隆和鉴定

目的　为构建人乳头瘤病毒 1 1型 (HPV1 1 )DNA疫苗 ,从尖锐湿疣病变组织中克隆疫苗靶基因E6。方法　利用改良提取染色体外游离DNA的方法制备模板DNA ,采用聚合酶链反应(PCR)技术进行基因克隆。结果　从病变组织中扩增出了全长人乳头瘤病毒 1 1型E6基因完整开放阅读框架 ,并插入中介载体T easy中构建重组质粒 ,转化JM1 0 9扩增后经酶切、PCR及测序分析 ,证实克隆成功。结论　该实验的成功为下一步制备HPV1 1的治疗性疫苗奠定基础。     

多房棘球绦虫重组Bb-Em14-3-3疫苗的构建及其表达效率

目的构建多房棘球绦虫(Em)重组双歧杆菌(Bb)-Em14-3-3疫苗,并研究Em14-3-3分子在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达效率。方法通过PCR扩增Em14-3-3抗原编码基因;将该基因定向克隆于含有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因的大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-Em14-3-3;用电穿孔法将该质粒导入Bb,构建多房棘球绦虫重组Bb-Em14-3-3疫苗。经PCR和酶切鉴定后以IPTG诱导表达Em14-3-3/GST融合蛋白;SDS-PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定。结果PCR成功扩增出530 bp的Em14-3-3基因;双酶切证实Em14-3-3基因插入pGEX-1λT中;PCR证实重组Bb-Em14-3-3疫苗构建成功;SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒转化宿主菌在IPTG诱导下高效表达了Em14-3-3/GST融合蛋白,表达效率为23%。结论成功构建了多房棘球绦虫重组Bb-Em14-3-3疫苗,重组质粒pGEX-Em14-3-3在大肠杆菌中获得了高效表达,Western blot结果提示表达出的Em14-3-3重组蛋白具有特异抗原性。     

应用富含GC区SNP分型的序列特异性PCR新方法检测子宫内膜癌特定位点C729T多态性

目的建立适合富含GC区SNP分型的序列特异性PCR方法,分析子宫内膜癌特定ERαExon3位点C729T多态性基因分型。方法选择22例子宫内膜癌患者与42例良性病患者为研究对象。建立富含GC区序列特异性PCR(SS-PCR)。将两对引物分别进行PCR扩增,所设计的两条特异性引物即内引物分别与DNA双链的两条单链相同,其3′端正好与SNP位点重合,由引物的3′端控制着引物的延伸反应,根据延伸产物的条带确定SNP类型;并通过在引物的3′端区域倒数第3位引入一个人为不匹配碱基来提高延伸反应的特异性。应用该方法鉴别Exon3 SNP位点C729T基因型,并通过直接测序法验证。结果建立的序列特异性PCR方法适合富含GC区SNP分型,能够准确分析子宫内膜癌的特定ERαExon3位点C729T多态性基因分型。结论富含GC区SNP分型的序列特异性PCR方法,可以用于子宫内膜癌的特定ERαExon3位点C729T多态性基因分型。     

新疆维吾尔族群体及家系STR遗传结构的研究

目的　了解新疆维吾尔族群体 4个STR位点的基因及基因型分布 ,获得 4个基因座的群体遗传学数据。方法　采用PCR扩增技术和基因扫描技术进行样本STR遗传结构分析。并与其他种族、人群的等位基因频率进行比较。结果　 4个STR位点在新疆维吾尔族人群中均具有遗传多态性。 4个STR位点的基因型分布均符合Hardy Weinberg平衡定律 (P >0 0 5 )。不同人群基因频率分布存在一定的差异。家系分析显示 :4个STR位点等位基因均按孟德尔遗传定律呈共显性传递。结论　所得到的等位基因频率等数据可为遗传学研究、法医个体识别及亲子鉴定提供依据     

毛状分裂增强子1诱导肝干细胞向胆管细胞的分化

目的 探讨毛状分裂增强子1(hairy enhancer of split 1,Hes1)调控肝干细胞(liver epithelial progenitor cells, LEPCs)向胆管细胞分化的作用。方法 将pTRE2hyg-Hes1和pTRE2hyg-EGFP-Hes1转染LEPCs,不同浓度强力霉素(doxycycline, DOX)诱导Hes1的表达。通过Western blotting、PCR、RT-PCR、Real-time PCR、免疫细胞化学和免疫荧光技术检测相关分子表达。以谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase, Gss)作为肝细胞分化的标记,以角蛋白19(keratin 19, Krt19)和肝核因子1β(hepatic nuclear factor 1β, HNF1β)为胆管细胞分化标记。结果 RT-PCR和Real-time PCR检测结果显示,随着DOX浓度的增加,Hes1在LEPCs细胞中的表达逐渐增高,当DOX浓度为10μg/mL时,Hes1表达是未加DOX时的11.21倍,第5天Hes1的表达处于高峰,持续到第7天;Weste...