兔骨髓基质干细胞的体外培养及生物学活性研究

目的 体外分离培养、鉴定兔骨髓基质干细胞(BMSCs)并探讨其分化潜能.方法 应用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法,体外分离培养兔骨髓来源的骨髓基质干细胞,培养过程中倒置显微镜下观察其生物学特性,HE染色和CD34、CD44免疫组织化学染色行细胞学鉴定;应用体外成骨与成脂诱导分化检测其生物学活性.结果 体外实验成功分离培养兔BMSCs,HE染色显示细胞均一性好;CD44强阳性表达,CD34阴性表达.诱导成骨结果显示BMSCs具有较强的成骨活性,ALP染色阳性;成脂诱导结果显示BMSCs具有较强的成脂活性,油红"O"脂肪染色阳性.结论 BMSCs体外具有潜在的多向分化能力.     

慢病毒载体介导GFP标记大鼠骨髓间充质干细胞

目的 探究慢病毒载体介导绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)标记大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的理想条件,以获得稳定高表达GFP的MSCs亚群.方法 慢病毒载体介导GFP以25、50、100、200和400的感染复数(multiplicity of infection, MOI)分别作用12h和24h感染MSCs,倒置荧光显微镜及流式细胞术检测各组的感染效率和荧光强度,MTT法评价感染对MSCs增殖的影响,从而确定理想的感染条件.平皿克隆套环法挑选理想条件下感染的MSCs单克隆.结果 MOI为100、200和400作用24h时,感染效率较高,分别为88.94%、99.65%、99.42%;MOI为100和200时,感染对MSCs增殖无影响,MOI为400时,感染的MSCs增殖减慢.挑选MOI为200、作用24h感染组的单克隆细胞,其1月时感染效率为99.95%,且荧光均一、强度很强.结论 MOI为200作用24h是慢病毒载体介导GFP标记MSCs的理想条件;通过细胞单克隆技术可获得稳定高表达GFP的MSCs亚群.     

人骨髓间充质干细胞生物学特性及腺病毒介导的GFP标记

目的建立人骨髓间充质干细胞(hMSCs)分离、培养以及鉴定的方法,同时应用腺病毒介导的绿色荧光蛋白(Ad-GFP)检测细胞转染的效率。方法应用人淋巴细胞分离液(Ficoll)对hMSCs进行分离,经贴壁纯化后用MTT法检测增殖能力;并对其成骨、成脂、成平滑肌诱导分别进行碱性磷酸酶(ALP)、油红O染色及α-SMA免疫细胞化学检测;采用流式细胞仪(FCM)检测细胞表面标志的表达。用Ad-GFP转染,并应用荧光显微镜与FCM检测转染效率。结果 hMSCs镜下为成纤维样形态,约在第4天进入对数增长期;分化诱导后ALP染色、Von kossa银染、油红O染色以及α-SMA均为阳性;FCM检测CD14、CD31、CD45表达阴性,CD44、CD73、CD106及PDGFRβ表达阳性;当感染复数MOI=200,细胞培养48h时感染效率较高,FCM检测显示为99.81%。结论经过对增殖、分化能力以及表面标志的分析,证明用Ficoll可以分离得到较纯的hMSCs,Ad-GFP可以很好地感染细胞,为组织工程种子细胞的体内示踪提供了途径。     

麝香酮含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞的增殖、分化的影响

目的研究麝香酮含药血清对骨髓间充质干细胞(BMSCs)的增殖及其向成骨细胞分化的影响,初步了解麝香酮单体对骨髓间充质干细胞的作用机制。方法贴壁筛选法提取大鼠BMSCs,培养至第3代,流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨成脂诱导,鉴定认为培养成功后,利用制备的不同浓度麝香酮含药血清干预。测定细胞增殖率、碱性磷酸酶(ALP)活性、钙盐沉积量、骨钙素分泌量等,研究麝香酮含药血清对大鼠干细胞增殖、分化的影响。结果筛选纯化的BMSCs呈均一的成纤维细胞样,贴壁生长,以长梭形为主;表型鉴定:CD45阴性,CD44、CD95均呈阳性表达;用含药血清干预后的增殖率、ALP活性、钙盐沉积量、骨钙素分泌量、钙化结节量均高于空白对照组。结论麝香酮含药血清可以促进BMSCs的增殖、成骨分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞与树枝状两亲性多肽自组装凝胶支架的生物相容性

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)与树枝状两亲性多肽自组装凝胶支架的生物相容性。方法获取大鼠BMSCs,传至第3代行流式细胞术表面抗原检测及成脂分化诱导鉴定干细胞。设计含双链-IKVAV活性集团的树枝状两亲性多肽,用固相合成法合成多肽,质谱仪(MS)测其分子量,高效液相色谱仪(HPLC)测其纯度;将10mg/mL树枝状两亲性多肽溶液在兔膝关节滑液作用下自组装为凝胶支架,透射电镜观察凝胶超微结构;1×109/L的BMSCs悬液分别接种于凝胶内部(三维培养体系)及多聚赖氨酸包被的盖玻片表面(二维培养体系),CCK-8法绘制细胞生长曲线。DEAD/LIVE双标染色,荧光显微镜观察BMSCs在三维多肽凝胶中成活及增殖情况。结果分离获取的细胞高表达CD29、CD90,不表达CD34、CD45,经成脂诱导2周出现脂滴,油红O染色成红色。MS测得合成多肽相对分子质量为2 344.2,与其理论值一致;HPLC分析其纯度为95.15%;透射电镜观察凝胶由多孔纳米纤维构成,纳米纤维直径为5~7nm,长度为数百纳米至数微米;CCK8试验示三维体系中细胞增殖率明显高于二维培养体系(P<0.05)。DEAD/LIVE双荧光染色后显示三维培养体系中细胞生存、增殖情况良好,未出现明显的细胞毒性导致细胞死亡。结论含-IKVAV活性基团的树枝状两亲性多肽与BMSCs具有良好的细胞相容性并能促进其增殖。     

大鼠肝脏干细胞的胰十二指肠同源盒基因表达系的构建与初步鉴定

目的 建立大鼠肝脏干细胞的Pdx-1基因表达系.方法 逆行穿刺SD大鼠乳鼠肝脏门静脉,经胶原酶Ⅳ消化并分离肝脏干细胞;免疫组织化学鉴定大鼠肝脏干细胞标志物细胞角蛋白18/19、甲胎蛋白的表达;构建pEGFP-Pdx-1表达载体并酶切鉴定,用脂质体2000介导表达载体转染大鼠肝脏干细胞后,荧光显微镜观察GFP表达,免疫组织化学鉴定Pdx-1的表达.结果 肝脏门静脉逆行穿刺分离培养大鼠肝脏干细胞具有分裂增殖能力、角蛋白18/19、甲胎蛋白表达阳性;pEGFP-Pdx-1表达载体转染后的肝脏干细胞可表达绿色荧光蛋白报告基因和Pdx-1蛋白.结论 成功建立了大鼠肝脏干细胞Pdx-1表达系.     

β-分泌酶底物肽反转录病毒载体及其包装细胞株的构建

目的用pLXSN反转录病毒载体构建介导β-分泌酶底物肽(BACEsp)基因表达的pLXSN-BACEsp反转录病毒载体,并建立高效、稳定表达BACEsp的包装细胞株。方法根据BACEsp基因序列设计引物,PCR合成的BAC-Esp片段和pLXSN载体用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切后连接,构建成表达BACEsp的pLXSN-BACEsp反转录病毒载体。用脂质体介导转染PT67包装细胞,经抗性筛选后,挑单克隆扩大培养,用NIH3T3细胞测定病毒滴度,筛选出高效产毒细胞株。结果经酶切、连接后构建成的质粒称为pLXSN-BACEsp,经测序证实构建成功,无任何碱基突变。经脂质体介导转染包装细胞、抗性筛选和测定病毒滴度,筛选出具有高病毒滴度的细胞集落,扩大培养后建立BAC-Esp高效表达的包装细胞株。结论成功构建了能表达BACEsp的pLXSN-BACEsp反转录病毒载体,并建立了稳定、高效地产生有活性的BACEsp产毒包装细胞株。     

反转录病毒载体介导的EGFP基因在SK-N-SH神经母细胞瘤细胞中的表达

目的构建携带报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的反转录病毒载体,并且探讨病毒载体对SK-N-SH神经母细胞瘤细胞株的感染效率。方法使用基因重组技术构建携带EGFP基因的反转录病毒载体(RV/EGFP)。将稀释的RV病毒液感染NIH3T3细胞,计数NIH3T3荧光表达细胞的数量来确定病毒的浓度;使用RV载体感染SK-N-SH细胞,通过流式细胞学荧光检测明确RV在SK-N-SH细胞的感染效率。结果成功构建了基因转移载体RV/EGFP,确定重组病毒的浓度为8.3×106病毒颗粒/mL。在SK-N-SH细胞RV/EGFP稳定转染并有效表达。在SK-N-SH细胞EGFP的荧光表达显示RV的转移并且表达的效率达到30%以上。结论SK-N-SH细胞能被RV病毒载体有效感染,在转基因细胞株外源基因的表达长期稳定并且显示RV病毒载体具有良好的基因转移效率。     

hGDF5基因转染对骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响

目的探讨人生长分化因子5(hGDF5)基因转染对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及分化的影响。方法采用脂质体介导方法将hGDF5基因转入体外培养的兔BMSCs,用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)、间接免疫荧光检测hGDF5 mRNA和蛋白质的表达,并通过检测碱性磷酸酶活性、细胞增殖能力(MTT法)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)以及蛋白多糖(PG)的表达,分析转染hGDF5对BMSCs增殖、分化的影响。结果hGDF5 mRNA及蛋白在基因转染细胞内得到正确表达;hGDF5基因转染组和对照组相比,ColⅡ、PG表达水平显著增高(P<0.01,P<0.01),而碱性磷酸酶活性和细胞增殖能力无明显变化(P>0.05)。结论外源基因转染可以使BMSCs表达有生物活性的hGDF5。高表达的hGDF5可以促进BMSCs向软骨表型分化,但对细胞增殖和碱性磷酸酶活性无明显影响。