生长因子诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化的研究

目的　建立一种体外分离兔骨髓间充质干细胞 (MSCs)的方法 ,诱导其表达软骨细胞表型。方法　抽取兔骨髓 ,经密度梯度离心和粘附分离得到MSCs。用生长因子诱导 ,观察细胞的增殖情况和软骨特异性基质的表达水平。结果　①纤维粘连蛋白促进MSCs贴壁 ,可提高细胞分离率 ;②TGF β1 ,IGF Ⅰ和维生素C结合可促进MSCs增殖 ,表达软骨特异性的Ⅱ型前胶原mRNA和基质蛋白多糖成分。结论　①密度梯度离心结合粘附分离可提高MSCs的分离效率。②TGF β1 ,IGF Ⅰ和维生素C结合诱导可促进MSCs增殖 ,表达软骨细胞表型     

黄芪多糖对X线辐射骨髓间充质干细胞成脂分化的影响

目的研究中药黄芪有效成分黄芪多糖(APS)对X射线照射人骨髓间充质干细胞成脂分化的影响。方法用50μg/mL的APS干预2 Gy X射线照射的人骨髓间充质干细胞,专用培养基诱导后,通过油红O法染色并计数观察干细胞的脂滴数量及大小,Western blot检测成脂相关蛋白(C/EBPα和PPAR-γ)表达变化。结果 X线辐射后骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞数量减少,成脂细胞中脂滴的面积明显减少(P<0.05),提前给予黄芪多糖的骨髓间充质干细胞组脂滴面积较单纯辐射组增加(P<0.05)。同样,X线辐射后,成脂相关蛋白过氧化物酶增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)和重组人CCAAT增强子结合蛋白(CEBPα)表达降低,而给予黄芪多糖干预后,PPAR-γ和CEBPα表达均升高(P<0.05)。结论 X线可损伤人骨髓间充质干细胞的定向成脂分化功能,黄芪多糖对X线辐射人骨髓间充质干细胞成脂分化功能具有一定的保护作用。     

胰岛素产生细胞的诱导分化及微囊对其分泌能力的影响

目的探讨微囊对胰岛素产生细胞(insulin-producing cells,IPCs)分泌能力的影响。方法分离培养小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)并传代纯化,应用大鼠胰腺提取物(rat pancreatic extract,RPE)对其进行诱导分化,诱导后的细胞随机分为微囊化组和未微囊化组。分别在1、2、3、4、5周等不同时间点,通过葡萄糖刺激实验,检测细胞的胰岛素与C肽释放情况。结果葡萄糖刺激实验结果显示,1周时微囊化IPCs与未微囊化的IPCs均能释放胰岛素,其量没有显著的差别;培养2周后未微囊化的IPCs胰岛素和C肽释放量开始下降,而微囊化IPCs胰岛素与C肽释放量在培养4周后才开始逐渐下降。结论微囊可延长IPCs的作用时间,有利于IPCs作用的发挥。     

豚鼠骨髓间充质干细胞培养及成骨细胞定向分化

目的　分离和培养豚鼠骨髓间充质干细胞 ,研究其成骨细胞分化特性。方法　采用成年豚鼠用贴壁法分离骨髓间充质干细胞并传代培养。取第三代培养细胞做细胞生长曲线测定。用 β 甘油磷酸钠、地塞米松和维生素C诱导使其向成骨细胞分化。Gomori钙钴法作碱性磷酸酶染色。结果　全培养骨髓细胞 ,连续 3d换液后能得到均一的骨髓间充质干细胞。豚鼠骨髓间充质干细胞群体倍增时间为 6 1h。用 β 甘油磷酸钠、地塞米松和维生素C诱导可以使其成骨细胞分化。碱性磷酸酶染色阳性。结论　贴壁法可用于分离骨髓间充质干细胞。豚鼠骨髓间充质干细胞具有药物诱导定向成骨细胞分化的特性     

兔动员外周血间充质干细胞集落形成能力与神经元诱导分化研究

目的研究动员后兔外周血间充质干细胞(PBMSCs)的存在频率,并对PBMSCs进行神经元诱导分化鉴定。方法采用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)皮下注射动员,结合密度梯度离心和贴壁培养法分离、培养兔外周血样品中的PBMSCs,利用集落形成率分析动员兔PBMSCs的存在频率,并对PBMSCs的神经元分化能力进行体外诱导鉴定。结果动员后的PBMSCs原代培养24h后,可见较多短梭形及多角形贴壁细胞,3～4d后出现集落样生长,传代培养的PBMSCs形态均一、呈长梭形漩涡状生长;未动员的外周血样品中的贴壁细胞少,集落形成少,且易老化,无法传代。集落形成率实验显示,动员后的PBMSCs在每百万外周血单个核细胞中有2.8～10.8个;而未动员组PBMSCs仅有0～3个。免疫细胞化学染色显示,PBMSCs经神经诱导7d后其神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经元特性核蛋白(NeuN)染色阳性。结论动员剂可提高兔外周血中的PBMSCs含量,所获取的PBMSCs具备神经元分化能力。     

软骨细胞-骨基质明胶复合物修复兔关节软骨缺损的初步观察

目的　初步观察骨基质明胶 (bonematrixgelatin ,BMG)复合软骨细胞移植修复关节软骨缺损的可行性。方法　BMG复合软骨细胞体外培养 ,并将培养复合物植入同种异体兔膝关节软骨缺损处 ,术后行大体及组织学观察。结果　BMG复合软骨细胞体外培养后能形成软骨组织 ,此“工程软骨”植入兔膝关节软骨缺损处能继续生长发育。结论　BMG复合软骨细胞体外培养及体内移植均能形成软骨组织 ,有可能修复关节软骨缺损     

麝香酮含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞的增殖、分化的影响

目的研究麝香酮含药血清对骨髓间充质干细胞(BMSCs)的增殖及其向成骨细胞分化的影响,初步了解麝香酮单体对骨髓间充质干细胞的作用机制。方法贴壁筛选法提取大鼠BMSCs,培养至第3代,流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨成脂诱导,鉴定认为培养成功后,利用制备的不同浓度麝香酮含药血清干预。测定细胞增殖率、碱性磷酸酶(ALP)活性、钙盐沉积量、骨钙素分泌量等,研究麝香酮含药血清对大鼠干细胞增殖、分化的影响。结果筛选纯化的BMSCs呈均一的成纤维细胞样,贴壁生长,以长梭形为主;表型鉴定:CD45阴性,CD44、CD95均呈阳性表达;用含药血清干预后的增殖率、ALP活性、钙盐沉积量、骨钙素分泌量、钙化结节量均高于空白对照组。结论麝香酮含药血清可以促进BMSCs的增殖、成骨分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞定向成骨细胞分化中碱性磷酸酶的变化

目的　研究大鼠骨髓间充质干细胞药物诱导定向成骨细胞分化特性及分化过程中碱性磷酸酶的变化。方法　用质量浓度为 1.0 73kg·L-1的Percoll分离骨髓间充质干细胞 ,再连续进行 3次换液以纯化骨髓间充质干细胞。加药物 β 甘油磷酸钠、地塞米松和维生素C诱导骨髓间充质干细胞定向成骨细胞分化。在加药后 5、10、15、2 0d用比色法检测细胞中碱性磷酸酶含量。改良Gomori染色 ,统计阳性细胞百分率。结果　梯度密度离心和黏附贴壁法联合使用可得到均一的骨髓间充质干细胞。用比色法测得在第 5、10、15、2 0d ,碱性磷酸酶含量 (A40 5)分别为 0 .391± 0 .0 2 14、0 .4 345± 0 .0 2 31、0 .8781± 0 .0 2 96和 0 .933± 0 .0 2 36 ;对照组为 0 .16 5 6± 0 .0 2 4 2、0 .15 2 8± 0 .0 2 15、0 .14 5 3± 0 .0 2 0 4和 0 .14 35± 0 .0 2 16。同时期改良Gomori染色阳性细胞率分别为 10 .35 %、11.4 8%、35 .2 8%和 4 6 .7%。结论　大鼠骨髓间充质干细胞经药物诱导后可以分化成成骨细胞。在分化过程中碱性磷酸酶含量从给药后的 10d左右才开始显著升高。在此过程中改良Gomori染色结果与其保持一致     

hGDF5基因转染对骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响

目的探讨人生长分化因子5(hGDF5)基因转染对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及分化的影响。方法采用脂质体介导方法将hGDF5基因转入体外培养的兔BMSCs,用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)、间接免疫荧光检测hGDF5 mRNA和蛋白质的表达,并通过检测碱性磷酸酶活性、细胞增殖能力(MTT法)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)以及蛋白多糖(PG)的表达,分析转染hGDF5对BMSCs增殖、分化的影响。结果hGDF5 mRNA及蛋白在基因转染细胞内得到正确表达;hGDF5基因转染组和对照组相比,ColⅡ、PG表达水平显著增高(P<0.01,P<0.01),而碱性磷酸酶活性和细胞增殖能力无明显变化(P>0.05)。结论外源基因转染可以使BMSCs表达有生物活性的hGDF5。高表达的hGDF5可以促进BMSCs向软骨表型分化,但对细胞增殖和碱性磷酸酶活性无明显影响。     

不同年龄段大鼠脂肪间充质干细胞生物学特性的研究

目的 观察不同年龄段大鼠脂肪间充质干细胞(adiposE-derived stromal cells, ADSCs)生物学特点与年龄的关系,为临床寻找理想的种子细胞并迅速获取所需ADSCs提供实验依据.方法 使用密度梯度离心法分离不同年龄段脂肪间充质干细胞进行培养,保留贴壁细胞传代,分析脂肪间充质干细胞的纯度,观察细胞生长情况,检测其增殖活性、细胞周期.结果 不同年龄段ADSCs均贴壁生长,呈典型ADSCs形态和生长特征,传代细胞的增殖速度比原代细胞快,但随着年龄的增长,原代及传代培养ADSCs的增殖能力下降,生长周期延长.结论 ADSCs的增殖能力和活性随着年龄的增长而降低,但各年龄段ADSCs均可满足临床不同患者组织工程种子细胞的要求.