MicroRNA-338-3p真核表达载体的构建及其对胃癌细胞SGC-7901增殖的影响

目的构建microR-338-3p(miR-338-3p)过表达载体并探究其对人胃癌SGC-7901细胞系体外增殖的影响。方法以pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体为基础,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切和纯化后与人工合成miR-338-3p的寡聚核苷酸进行连接,转化至E.Coli Top10后,经过DNA测序、BLAST检测及验证;将构建成功的载体瞬时转染入SGC-7901细胞系中,应用Real-time PCR检测miR-338-3p的表达水平,利用MTT法检测细胞增殖的改变。结果测序验证成功构建了miR-338-3p的真核表达载体;瞬时转染SGC-7901细胞后miR-338-3p表达水平有显著增加,能够抑制SGC-7901细胞的体外增殖。结论成功构建了miR-338-3p的真核表达载体,获得了瞬时表达miR-338-3p的人胃癌SGC-7901细胞系,初步证实miR-338-3p过表达可抑制肿瘤细胞的增殖。     

miR-3127-5p靶向抑制Cdk10表达促进肝癌细胞迁移与侵袭

目的探究miR-3127-5p在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中的表达情况、临床意义及作用机制。方法实时定量PCR (qPCR)检测miR-3127-5p在HCC组织与癌旁组织、正常肝细胞(L02)与HCC细胞系中的表达情况;TCGA数据库分析正常肝组织及肝癌组织中miR-3127-5p的表达差异;分析miR-3127-5p的表达与HCC患者临床病理特征及预后的关系;在HCCLM3细胞中敲减miR-3127-5p,Transwell实验来检测细胞侵袭及迁移能力;TargetScan数据库预测miR-3127-5p下游靶基因,并通过双荧光素酶报告基因实验加以验证。结果与癌旁组织和正常肝细胞相比,miR-3127-5p在HCC组织及细胞系中均高表达(P<0.05),与门静脉癌栓(P=0.016)及TNM分期(P=0.016)有关;基于TCGA数据库数据的生存分析显示,miR-3127-5p高表达与不良预后相关(P=0.002);在HCCLM3细胞中敲减miR-3127-5p抑制细胞的侵袭及迁移;通过生物信息学预测并通过双荧光素酶报告基因实验证实细胞周期素依赖性激酶10(cyclin-dependent kinase 10, Cdk10)是miR-3127-5p的直接靶基因,回复实验证实Cdk10介导了miR-3127-5p对肝癌细胞侵袭及迁移能力的促进作用。结论在HCC中miR-3127-5p通过靶向抑制抑癌基因Cdk10从而促进肝癌细胞侵袭及迁移。     

miR-3691-5p靶向抑制TET1表达促进肝癌细胞迁移与侵袭

目的探讨肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中miR-3691-5p的表达、临床意义及作用机制。方法实时定量PCR(qPCR)检测miR-3691-5p在HCC组织与癌旁组织、正常肝细胞(L02)与HCC细胞系中的表达;TCGA数据库分析正常肝组织及肝癌组织中miR-3691-5p的表达差异,分析miR-3691-5p的表达与HCC患者临床病理特征及预后的关系;在MHCC97-H细胞中敲减miR-3691-5p,Transwell实验评价细胞侵袭及迁移能力;TargetScan数据库预测下游靶基因,并通过双荧光素酶报告基因实验加以验证。结果与癌旁组织和正常肝细胞相比,miR-3691-5p在HCC组织及细胞系中均呈现高表达(P<0.05),并与门静脉侵犯(P=0.006)、TNM分期(P=0.008)及Edmondson分级(P=0.001)有关;基于TCGA数据库数据的生存分析显示,miR-3691-5p高表达与不良预后相关(P=0.016);在MHCC97-H细胞中敲减miR-3691-5p抑制细胞的侵袭及迁移;通过生物信息学预测并通过双荧光素酶报告基因实验证实,TET1(Ten-Eleven Translocation 1)是miR-3691-5p的直接靶基因,回复实验证实TET1介导了miR-3691-5p对肝癌细胞侵袭及迁移能力的促进作用。结论 miR-3691-5p在HCC中通过靶向抑制抑癌基因TET1促进肝癌细胞侵袭及迁移。     

miR-21在肾透明细胞癌中的表达及对增殖和凋亡的影响

目的探讨miR-21在肾透明细胞癌中的表达及其临床意义,以及如何通过调节程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)的表达影响786-O肾透明细胞癌细胞系的增殖和凋亡。方法通过分析The Cancer Genome Atlas(TCGA)肾透明细胞癌数据库,比较癌组织及正常癌旁组织中miR-21的表达水平;分析miR-21表达水平在不同临床病理分期肾癌组织中的差异;采用Kaplan-Meier法和对数秩和检验(Log-rank test)研究miR-21表达水平和患者生存之间的关系;通过转染miR-21抑制性核苷酸(AS-miR-21)下调miR-21表达水平,采用MTT和流式细胞术分别检测细胞增殖和凋亡,采用实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot测量PDCD4mRNA和蛋白质表达水平变化,采用双荧光素报告系统检测miR-21对PDCD4的直接调节。结果肾透明细胞癌组织中miR-21的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.000 1)。miR-21在Ⅲ期和Ⅳ期肾癌组织中表达水平显著高于Ⅰ期(P均<0.000 1),miR-21表达水平与临床病理分期呈正相关(r=0.262,P<0.000 1)。miR-21表达水平与T分期(r=0.250,P<0.000 1)与淋巴结转移阳性(N1)以及远处转移均呈正相关(P均<0.001)。生存分析显示miR-21高表达患者中位生存时间显著短于miR-21低表达者中位生存时间(Log-rank,P<0.001)。下调miR-21后,786-O细胞的增殖能力较对照显著降低(P<0.05),凋亡显著增加(P=0.005),PDCD4mRNA(P=0.002)和蛋白质表达水平显著增高。双荧光素报告实验显示在转染AS-miR-21的细胞内PDCD4相对荧光强度较对照细胞显著升高(P=0.003)。结论 miR-21在肾透明细胞癌组织中表达升高,与患者临床病理分期呈正相关,和患者生存呈负相关;miR-21可能通过调节PDCD4表达水平,参与调节肾透明细胞癌细胞的增殖和凋亡。     

miR-384-5p通过阻断BMP7转录后调控促进肾纤维化

目的研究miR-384-5p是否通过调节肾小管上皮细胞BMP7转录而影响肾纤维化。方法建立小鼠单侧输尿管阻塞模型(unilateral ureteral obstructive, UUO),流式细胞仪荧光激活细胞分选(FACS)分离肾组织获取肾小管上皮细胞进行培养,通过脂质体转染表达miR-384-5p的质粒、表达反义miR-384-5p的质粒及空白质粒;静脉注射空质粒(n=10)或反义-miR-384-5p质粒(n=10),14周后处死UUO模型小鼠,肾组织切片进行Masson三色染色评估肾纤维化程度;Western blot和实时定量PCR检测miRNA靶基因(miR-384-5p、miR-30、miR-92和miR-128)表达。结果 UUO模型14 d时肾脏出现明显纤维化,肾组织BMP7 mRNA明显增加,但BMP7蛋白无明显增加。miR-384-5p没有影响肾小管上皮细胞中BMP7 mRNA表达,但是过表达miR-384-5p的肾小管上皮细胞中BMP7蛋白明显减少,过表达反义miR-384-5p的肾小管上皮细胞中BMP7蛋白明显增加。免疫组化和定量PCR检测结果显示,UUO小鼠14 d肾组织纤维化显著增加,而注射反义miR-384-5p组肾组织纤维化程度明显减轻。虽然反义-miR-384-5p处理后不影响BMP7 mRNA水平,但能明显增加肾脏组织BMP7蛋白表达,提示抑制miR-384-5p能减轻UUO大鼠的肾损伤。结论 miR-384-5p是调节肾损伤后纤维化机制的关键因子,靶向miR-384-5p有希望成为防治肾脏纤维化的新方法。     

miR-450b-5p在肝细胞癌中的表达及功能

目的探究miR-450b-5p在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达情况、临床意义及生物学功能,并初步探究其潜在的作用机制。方法 Real-time PCR检测miR-450b-5p在HCC组织和细胞系的表达情况;分析miR-450b-5p的表达水平与HCC临床病理特征及患者预后的相关性,并用Cox多因素回归分析法分析患者的独立预后因素;采用Transwell迁移和侵袭实验检测miR-450b-5p对HCC细胞迁移与侵袭能力的影响;MTT实验观察miR-450b-5p对HCC细胞增殖能力的影响;应用生物信息学工具预测miR-450b-5p的下游靶点,并应用荧光素酶报告实验及Western blot分析miR-450b-5p对靶点的调节作用。结果 miR-450b-5p在HCC组织和细胞系中的表达均明显降低(均P<0.001);miR-450b-5p的表达水平与肿瘤大小(P=0.026)、静脉侵犯(P=0.013)、TNM分期(P=0.020)及HCC患者的预后(P=0.014 2)相关,且Cox多因素回归分析结果显示miR-450b-5p为HCC患者的独立预后因素之一;上调MHCC-97H细胞的miR-450b-5p表达后,细胞迁移、侵袭和增殖能力显著被抑制;而下调Hep3B的miR-450b-5p表达时,细胞的迁移、侵袭和增殖能力明显增强;生物信息学分析发现,性别决定区Y框蛋白2(sex determining region Y-box2,SOX2)可能是miR-450b-5p的作用靶点;荧光素酶报告实验显示,miR-450b-5p能够负向调节SOX2-3′UTR的荧光素酶活性;miR-450b-5p mimics能降低MHCC-97H细胞中SOX2的表达水平,miR-450b-5p inhibitors能上调Hep3B细胞中SOX2的表达水平。结论 miR-450b-5p通过靶向作用于SOX2抑制HCC细胞的迁移、侵袭及增殖,进而抑制HCC的发生发展。     

miR-153-3p靶向TGFβ2对胶质瘤细胞侵袭、迁移及上皮间质转化的影响

目的探究miR-153-3p与转化生长因子β2(transforming growth factor-beta 2,TGFβ2)的靶向关系以及对体外培养胶质瘤细胞侵袭、迁移和上皮间质转化的影响。方法实时荧光定量PCR和Western blot检测miR-153-3p对SHG-44细胞TGFβ2mRNA和蛋白表达的影响;生物信息学软件预测miR-153-3p与TGFβ2的结合位点;荧光素酶报告实验分析miR-153-3p与TGFβ2的靶向关系;体外侵袭实验和划痕实验检测miR-153-3p对SHG-44细胞侵袭和迁移能力的影响;Western blot检测侵袭、迁移和上皮间质转化相关蛋白的表达。结果 miR-153-3p mimic抑制SHG-44细胞中TGFβ2mRNA和蛋白质的表达;软件预测显示miR-153-3p与TGFβ2存在连续的结合区域;miR-153-3p mimic与TGFβ2野生型报告载体共转后,细胞中荧光素酶的活性降低(P<0.01);miR-153-3p mimic与TGFβ2突变型报告载体共转后,细胞中荧光素酶的活性没有明显变化。miR-153-3p mimic转染SHG-44细胞后,侵袭细胞数目减少,划痕闭合率降低,基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase,MMP-2)、MMP-9、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达降低,神经钙黏蛋白(N-cadherin)、Snail-2、波形蛋白(Vimentin)和Twist的表达降低,上皮钙黏蛋白(E-cadherin)的表达升高(P<0.01);TGFβ2高表达缓解miR-153-3p mimic对SHG-44细胞侵袭、上皮间质转化相关蛋白的表达。结论 miR-153-3p靶向TGFβ2抑制体外培养胶质瘤细胞侵袭、迁移和上皮间质转化。     

miR-106b对鼻咽癌细胞凋亡的促进和对增殖的抑制作用

目的探讨miR-106b对鼻咽癌细胞凋亡和增殖的影响。方法应用miRNA芯片分析获得鼻咽癌组织和癌旁正常组织表达差异的miRNA,TaqMan miRNA检测试剂盒和实时荧光定量PCR分别检测miR-106和RhoC mRNA在鼻咽癌和癌旁组织中的表达,用miRnada预测miR-106b和靶基因的结合位点,采用双荧光素酶验证靶基因,Western blot检测miR-106b调控靶基因RhoC的表达水平。用Annexin V-PI和TUNEL检测miR-106b对鼻咽癌细胞凋亡的影响,用MTT检测miR-106b对鼻咽癌细胞增殖的影响。结果 miRNA芯片分析发现鼻咽癌组织中miR-106b的表达较癌旁正常组织低。RT-PCR结果显示miR-106b在鼻咽癌组织中表达减少(P<0.05),RhoC在鼻咽癌组织中表达增加(P<0.05),miR-106b和RhoC在鼻咽癌组织中表达呈负相关(r=―0.586 6,P<0.001)。荧光素酶报告基因实验结果显示miR-106b组荧光素酶活性低于空质粒组(P<0.05),Western blot结果显示miR-106b组鼻咽癌细胞中RhoC的表达较空质粒组降低(P<0.05)。Annexin V-PI和TUNEL结果显示,miR-106b组鼻咽癌细胞凋亡较空质粒组增加(P<0.05);MTT结果显示miR-106b组鼻咽癌细胞增殖能力较空质粒组降低(P<0.05)。结论 miR-106b可能通过下调RhoC的表达诱导鼻咽癌细胞凋亡并抑制鼻咽癌细胞增殖。     

上调miR-181a对胃癌细胞AGS增殖和凋亡的影响

目的探讨miR-181a对胃癌细胞增殖、周期及凋亡的影响及其作用机制。方法荧光实时定量PCR检测5种胃癌细胞及人胃黏膜细胞系GES-1中miR-181a的表达情况,以及胃癌细胞AGS瞬时转染miR-181amimic后miR-181a的表达情况;MTT法和流式细胞仪检测上调miR-181a表达对胃癌细胞AGS增殖、周期和凋亡等生物学行为的影响;Western blot检测上调miR-181a后细胞周期调控蛋白(CDC25A、cyclinA2、cyclinD1、p21)和凋亡相关蛋白(Bcl-2和Bax)的表达变化。结果与人胃黏膜细胞系GES-1比较,miR-181a在人胃癌细胞株SGC-7901和MKN28表达升高(P均<0.01),在MGC-803、BGC-823、AGS表达差异无统计学意义(P均>0.05);瞬时转染miR-181amimic后,胃癌细胞AGS中miR-181a的表达明显上调(P<0.05);转染miR-181amimics后AGS细胞增殖明显,G0/G1期细胞减少,S期细胞明显增多,细胞凋亡明显减弱(P均<0.05)。Western blot结果显示,上调miR-181a后胃癌细胞AGS中CDC25A、cyclinA2和Bcl-2表达升高(P均<0.05),cyclinD1和p21表达差异没有统计学意义(P>0.05),Bax表达降低(P<0.05)。结论上调miR-181a可以促进胃癌细胞AGS增殖,其作用机制可能与CDC25A、CyclinA2表达升高有关;上调miR-181a可抑制胃癌细胞凋亡,其作用机制可能与Bcl-2表达升高及Bax表达降低有关。     

NANOG在肝细胞癌中的表达及意义

目的探讨NANOG在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)癌组织中的表达,并通过下调肝癌MHCC-97H细胞中NANOG的水平观察其对MHCC-97H细胞侵袭和迁移能力的影响。方法收集89例HCC组织及对应的癌旁组织,应用免疫组化检测NANOG蛋白在肝癌及对应癌旁组织中的表达,并分析其表达与肝癌临床病理特征的关系。采用小干扰RNA(siRNA)下调肝癌MHCC-97H细胞中NANOG水平,Transwell实验检测MHCC-97H细胞的侵袭及迁移能力。结果 NANOG在肝癌组织中表达水平显著高于相应癌旁组织;肝癌组织中NANOG高表达与肿瘤大小、TNM分期、门静脉侵犯及Edmondson分级显著相关;NANOG高表达患者3年生存率明显低于低表达组;特异性siRNA下调NANOG水平后,明显抑制MHCC-97H细胞的侵袭和迁移。结论 NANOG在肝癌组织中的表达上调并与肝癌恶性临床病理特征有关,下调NANOG明显抑制肝癌细胞的侵袭和迁移能力。     

隧道出渣设备最佳配合分析

针对隧道出渣时,装载机与倾卸车联合作业中的配合问题进行了深入的研究,分析并建立两种施工机械最佳配合关系的数学模型,通过实例计算表明,此模型及算法对施工单位在隧道施工中合理地确定两者数量关系具有一定的指导意义.     

中国经济增长的波动分析

对国民经济增长的波动进行计算分析。应用Mexican Hat小波对国内生产总值（GDP）的增长率进行多时间尺度分析，再利用宏观经济学的理论从政府宏观调控政策、投资、消费等方面分析引起波动的原因。在不同时间尺度下，经济波动受到政策、投资和消费及重大政治事件的影响。通过对经济增长波动的因素及规律的分析，可以提高对经济发展的预见性，促进经济更好的增长。     

合阳嘉陵江大桥桥墩局部阻力系数研究

针对合阳嘉陵江大桥桥墩及拱圈形状结构 ,通过水槽实验 ,建立了在不同桥墩形状、桥墩数目、淹没水深、水流与桥轴线法向夹角等影响因素综合作用下 ,桥梁局部阻力系数公式 .可供今后类似桥型桥梁洪水壅水曲线计算时参考     

桥梁板式橡胶支座抗压弹性模量分析

简要介绍桥梁板式橡胶支座抗压弹性模量的计算及试验方法,同时从几个方面分析影响该指标的因素.     

弓网离线模拟试验平台的设计

受流问题是制约电气化铁路提速的瓶颈之一,而弓网离线电弧是高速列车受流的关键问题.为了全面的把握弓网离线状态,设计了弓网离线模拟试验平台.实现正弦周期内不同时刻离线及回合过程的电弧放电现象,并采用示波器和数据采集卡实现对离合瞬间电压、电流和光强等波形的同步记录,为弓网离线检测法和列车受流质量的研究及抑制电弧危害打下基础.     

钢筋混凝土简支梁桥梁体病害分析及维修方法

随着经济的发展、综合国力增强,交通事业日新越益发展,桥梁建设取得了长足的进步,为我国的各项事业的发展提供了坚强的基础,但随之而来的桥梁病害问题也日益严重,针对上述情况,本文将对钢筋混凝土简支梁桥梁体的常见病害进行归纳和总结,并提出一定的维修措施,以便能够减轻同类病害的发生,为今后的公路事业发展提供参考依据.     

高速公路采空区治理的监理

针对衡枣高速公路途径的采空区治理问题，介绍了采空区从勘探、治理到质量检验全过程的监理工作。描述了采空区的治理情况和监理工作思路、方法，指出了采空区治理监理工作中应把握的工作要点。     

速腾轿车蓄电池亏电故障检修

一辆搭载BPL型发动机的一汽大众速腾1．8L轿车,该车在停放时偶尔会发出“嗡嗡的异响”,并出现发动机无法启动的故障现象。经检查,发现车辆熄火后冷却风扇偶尔会自行运转。结合其电源管理系统,通过分析冷却风扇的工作原理及电路图,发现故障是由于主继电器的不正常吸合引起的,更换主继电器,故障排除。     

Assessment of Quality of Service of Virtual Knowledge Communities

An assessment method for the quality of service (QoS) of virtual knowledge communities (VKC) is proposed based on fuzzy theory and analytic hierarchy process (AHP). The QoS is evaluated in terms of Website design, reliability, responsiveness, trust,personalization, and information quality. The cognitive QoS and the QoS evaluated by assessors are compared to analyze which QoS of the VKC should be improved urgently and which indicators keep leading positions, and to assist administrators of the VKC on measuring and understanding current status and implementation effect of the QoS.     

聚丙烯纤维混凝土配合比均匀性研究

聚丙烯纤维混凝土以其独有的特点,越来越得到广泛的应用.介绍了利用均匀设计法对聚丙烯纤维混凝土的配合比进行优化分析的过程,选取水泥、速凝剂掺量、聚丙烯纤维掺量三个影响因素,对混凝土配比试件的试验数据统计结果进行回归分析,结果表明,在设定试验条件下,在每立方米混凝土中掺入0.9kg聚丙烯纤维的方案是比较合理的.