不同胚龄昆明小鼠胚胎获取胚胎干细胞体外培养的比较

目的 探讨分离培养昆明小鼠胚胎干细胞(ES细胞)的最佳胚龄.方法 分别从孕3.5 d和4.5 d的母鼠子宫中分离收集桑椹胚和囊胚.比较体外培养时胚胎的贴壁率、内细胞团(inner cell mass,ICM)形成率、形成ES细胞克隆率(P1)和形成ES细胞亚克隆率(P2).结果 孕3.5 d采集的胚胎多为桑椹胚,孕4.5 d采集的胚胎多为囊胚,分离培养结果表明.后者的胚胎贴壁率、ICM形成率和ES细胞克隆形成率均高于前者,均有显著性差异(P<0.05).结论 囊胚较桑葚胚更适合作为体外分离培养昆明小鼠ES细胞的材料.     

神经干细胞的分离培养与鉴定

目的　分离培养新生鼠神经干细胞并获得细胞克隆 ,同时建立良好的传代方法。方法　取新生大鼠大脑室管膜、脑室周围及海马细胞 ,经消化及机械吹打后接种于加有N2添加剂及生长因子的DMEM/F12 培养基 ,悬浮培养 ;用含血清而不含生长因子的培养基贴壁培养 ,促使分化 ;最后用免疫细胞化学方法进行染色鉴定。结果　分离培养的细胞多聚集生长 ,并形成细胞克隆 ,可以传代 ;细胞为圆形或椭圆形 ,经鉴定为nestin抗原阳性 ;分化后细胞分别表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特异性抗原。结论　分离培养的细胞具有自我更新和多向分化能力 ,表达神经干细胞的特异性抗原nestin ,是神经系统的干细胞。     

早期人胚神经干细胞分布及分离培养

目的　研究发育早期人胚脑神经干细胞的形态特征及其分布情况 ,并观察其体外生长分化特性。方法　计划生育流产的 6～ 12周胚胎大脑组织切片用vimentin抗体进行免疫组织化学染色 ,光镜观察。机械分离皮质细胞 ,用无血清培养基和含血清培养基进行悬浮和贴壁培养 ,分别用MAP2 、GFAP及GalC抗体进行免疫细胞化学染色 ,鉴定干细胞和神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。结果　发育早期大脑Vimentin阳性细胞分布广泛 ,细胞形态单一 ,多呈圆球形 ,体积较小。体外培养的大脑皮质细胞在培养的第 5～ 7天时 ,形成较多克隆 ,可多次传代 ;贴壁培养时细胞发生分化 ,分别为MAP2 、GFAP、GalC阳性的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。结论　胚胎发育早期大脑神经干细胞分布广泛 ,形态单一 ,皮质Vimentin阳性细胞数量多 ,便于分离 ,是最佳神经干细胞分离部位 ;人NSCs可以在体外增殖并发生多向分化     

骨髓间质干细胞的分离培养与鉴定

目的建立兔骨髓间质干细胞(MSCs)的体外分离纯化、扩增和鉴定的方法,为MSCs的进一步诱导分化和应用奠定基础。方法抽取兔胫骨骨髓,密度梯度离心,得到骨髓单个核细胞,接种后形成单层贴壁细胞,经胰蛋白酶消化后传代培养扩增,倒置显微镜下观察原代和传代细胞的生长特性。通过免疫荧光组织化学、流式细胞分析和透射电镜鉴定细胞。结果分离培养的骨髓MSCs贴壁、呈梭形,原代细胞呈集落生长,7～10d达到融合,传代后增殖速度加快;骨髓MSCs表达CD90,反复传代后表达效率增高,不表达CD34;透射电镜可见细胞表面有大量的绒毛突起,胞浆中有丰富的粗面内质网和线粒体,核大,形态不规则。结论密度梯度离心结合贴壁法,以及消化传代能有效分离纯化和扩增骨髓MSCs,分离培养的细胞具有骨髓MSCs的基本表型和特性。     

小鼠胚胎成纤维细胞对Lewis肺癌细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)是否具有肿瘤相关成纤维细胞相似的生物学活性.方法 原代培养MEF并经细胞免疫组化法鉴定α-SMA的表达情况;收集培养48h无血清高糖DMEM培养基上清并制备条件培养基MEF-CM,根据实验中Lewis肺癌细胞(LLC)细胞培养基不同,分为MEF条件培养基组、DMEM组,应用MTT法...     

兔骨髓基质干细胞的体外培养及生物学活性研究

目的 体外分离培养、鉴定兔骨髓基质干细胞(BMSCs)并探讨其分化潜能.方法 应用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法,体外分离培养兔骨髓来源的骨髓基质干细胞,培养过程中倒置显微镜下观察其生物学特性,HE染色和CD34、CD44免疫组织化学染色行细胞学鉴定;应用体外成骨与成脂诱导分化检测其生物学活性.结果 体外实验成功分离培养兔BMSCs,HE染色显示细胞均一性好;CD44强阳性表达,CD34阴性表达.诱导成骨结果显示BMSCs具有较强的成骨活性,ALP染色阳性;成脂诱导结果显示BMSCs具有较强的成脂活性,油红"O"脂肪染色阳性.结论 BMSCs体外具有潜在的多向分化能力.     

短期自愿运动对高脂血症小鼠脑出血后内源性神经干细胞的影响

目的 探究短期自愿运动对高脂血症小鼠脑出血(intracerebral hemorrhage, ICH)后神经功能修复和内源性神经干细胞(endogenous neural stem cells, eNSCs)激活的影响。方法 4月龄Nestin-CreERT2:tdTomato转基因C57BL/6雄性小鼠,8周高脂饮食(high fat diet, HFD)喂养后,立体定位仪辅助下纹状体注射Ⅳ型胶原酶,构建ICH模型。ICH后2 d小鼠开始自主转轮运动,连续7 d;在运动第1、3、5、7天采用NSS、Beam walking实验评估小鼠神经功能;脑组织免疫荧光染色观察侧脑室下区Nestin、Ki67和DCX阳性细胞数量,评估eNSCs激活。结果 (1)与正常饮食(chow diet, CD)组相比,HFD组小鼠8周后体质量、血糖、血清脂质代谢相关因子浓度明显升高,肝脏组织Nile Red染色阳性细胞明显增加。(2)与假手术(Sham)组相比,ICH组小鼠NSS评分明显升高、Beam walking距离缩短。运动(Ex)组小鼠NSS评分较非运动组下降、Beam walking距离增加,...     

3-羟基丁酸对体外培养大鼠皮质神经干细胞增殖分化的影响

目的研究体外条件下3-羟基丁酸(3-HB)对神经干细胞(NSCs)增殖及分化的影响。方法分离培养孕14.5d大鼠胚胎大脑皮质NSCs,分别以不同质量浓度3-HB(0.1、0.05、0.02、0.01g/L)处理培养至第3代的NSCs,以未加药组作为对照。CCK-8试剂盒检测细胞增殖、活力,免疫细胞化学染色观察NSCs的分化情况。结果与对照组相比,3-HB对NSCs的增殖、活力没有显著影响,但3-HB处理组NSCs分化为β-tubulinⅢ阳性细胞(神经元)的比例增加,而分化为GFAP阳性细胞(胶质细胞)的比例没有显著变化。结论 3-HB不影响NSCs的增殖,但可促进其向神经元方向分化。     

TGF-β诱导骨髓干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的探讨转化生长因子β(TGF-β)对骨髓间充质干细胞(MSCs)定向分化为心肌样细胞的影响。方法取SD大鼠四肢骨骨髓,分离培养MSCs,应用TGF-β1对第二代MSCs定向诱导,相差显微镜观察细胞形态学变化,应用免疫细胞化学技术检测诱导后4周MSCs结蛋白(desmin),α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)、心肌肌钙蛋白T(CTnT)及p38MAPK的表达情况,并根据CTnT这一心肌源性特异性标记物的阳性率,分析心肌细胞的转化率;同时,以半定量RT-PCR方法在诱导后7、21、28d检测细胞心肌早期转录因子GATA-4和心肌特异性肌凝蛋白重链α-MHC的表达。结果①加入TGF-β1诱导后的MSCs,于7d时形态已转变成类长柱形,28d时细胞体积则变小,呈条梭状排列,可观察到类肌管样结构。②TGF-β1诱导4周后的MSCs均可见desmin、α-sarcomeric actin及p38MAPK阳性细胞。诱导组的心肌样细胞转化率均显著高于对照组(P均<0.01)。③RT-PCR结果显示,诱导组细胞GATA-4于诱导后7d弱表达,21d表达增强,28d表达减弱。α-MHC在诱导后7d不表达,21d弱表达,28d表达明显。结论骨髓间充质干细胞在TGF-β诱导下可定向分化为心肌样细胞。     

大鼠脑发育过程中神经干细胞分布的免疫组织化学研究

目的　观察神经干细胞在大鼠不同发育时期不同脑区的分布。方法　应用免疫组织化学ABC法 ,对不同发育时期大鼠脑的嗅球、室管膜、室管膜下区、顶叶皮质、纹状体、海马齿状回进行nestin免疫组织化学染色及光镜观察。结果　nestin从胚胎 1 8d至出生后 7d在脑内表达较强 ,阳性细胞在所观察的部位较多 ,出生后 1月nestin阳性细胞数急剧下降 ,成年鼠和老年鼠仅在嗅球、室管膜、部分室管膜下区及海马齿状回分布有nestin阳性细胞。结论　嗅球、室管膜、室管膜下区及海马齿状回终生具有神经干细胞存在 ,可能具有神经再生功能     

多步骤诱导逐步筛选法建立高效的胚胎干细胞定向分化为胰岛祖细胞的分化方案

目的探讨胚胎干细胞(ESCs)体外定向分化为胰岛祖细胞的分化潜能,应用多步骤诱导逐步筛选法建立高效的胚胎干细胞定向分化为胰岛祖细胞的分化方案,提高胚胎干细胞向胰岛祖细胞分化的效率。方法体外传代培养ESCs,采用逐步筛选分化方案,在不同的分化阶段,给予不同的生长因子诱导分化后,RT-PCR法检测胰腺特异性基因的表达,筛选最佳的诱导因子组合,并用免疫细胞化学方法鉴定相关特异蛋白的表达,从而建立体外高效的定向分化方案。结果从未分化ESCs定向分化为定形内胚层细胞,以活化素A诱导组的Sox17和Foxa2基因表达最显著;从定形内胚层细胞分化到后前肠细胞,以维甲酸+FGF10诱导组的Hnf4a和Hnf6基因表达最显著;从后前肠细胞定向分化到胰腺内胚层细胞,以维甲酸+环杷明+DAPT+Exendin 4诱导组的Pdx1、Ptf1a、Hblx9等胰腺特异性基因表达最显著;从胰腺内胚层细胞定向分化到胰岛祖细胞,以维甲酸+DAPT+Exendin 4诱导组的Ngn3、Nkx6.1、Pax4、Pax6等基因表达最显著。免疫细胞化学方法检测可见胰腺特异性的相关蛋白表达,多数Ngn3+细胞同时表达胰腺特异性基因Nkx6.1和Pdx1。结论应用多步骤诱导逐步筛选法可以建立高效的ESCs定向分化为胰岛祖细胞的分化方案,提高ESCs向胰腺内胚层分化的分化效率,为1型糖尿病的β细胞再生治疗提供试验依据和可行性方案。     

豚鼠骨髓间充质干细胞培养及成骨细胞定向分化

目的　分离和培养豚鼠骨髓间充质干细胞 ,研究其成骨细胞分化特性。方法　采用成年豚鼠用贴壁法分离骨髓间充质干细胞并传代培养。取第三代培养细胞做细胞生长曲线测定。用 β 甘油磷酸钠、地塞米松和维生素C诱导使其向成骨细胞分化。Gomori钙钴法作碱性磷酸酶染色。结果　全培养骨髓细胞 ,连续 3d换液后能得到均一的骨髓间充质干细胞。豚鼠骨髓间充质干细胞群体倍增时间为 6 1h。用 β 甘油磷酸钠、地塞米松和维生素C诱导可以使其成骨细胞分化。碱性磷酸酶染色阳性。结论　贴壁法可用于分离骨髓间充质干细胞。豚鼠骨髓间充质干细胞具有药物诱导定向成骨细胞分化的特性     

子宫内膜基质干细胞的体外成骨诱导和成脂诱导分化

目的探讨子宫内膜基质干细胞的多向分化潜能。方法取因子宫肌瘤行全子宫切除术患者的子宫内膜组织,磁珠分选子宫内膜基质干细胞,进行传代培养。传代细胞分别加入成骨诱导剂和成脂诱导剂培养,并通过茜素红和油红O染色对成骨细胞和脂肪细胞形态进行鉴定。结果子宫内膜基质干细胞呈成纤维细胞样贴壁生长,其经成骨、成脂诱导培养3周后形态、体积发生明显改变。茜素红染色显示细胞团中央能形成钙化结节;成脂诱导后油红O染色可见细胞质内出现橙红色脂滴。结论子宫内膜基质干细胞经体外诱导培养后可向成骨细胞和脂肪细胞分化,并具有明显的成骨和成脂细胞形态,表明子宫内膜基质干细胞具有多向分化潜能。     

Identification and culture of neural stem cells isolated from adult rat subventricular zone following fluid percussion brain injury

Objective To analyze proliferation and differentiation of glial fibrillary acid protein (GFAP)- and nestin-positive (GFAP+/nestin+) cells isolated from the subventricular zone following fluid percussion brain injury to determine whether GFAP+/nestin+ cells exhibit characteristics of neural stem cells. Methods Male Sprague-Dawley rats, aged 12 weeks and weighing 200-250 g, were randomly and evenly assigned to normal control group and model group. In the model group, a rat model of fluid percussion brain injury was established. Five days later, subventricular zone tissue was resected from each group and made into single cell suspension. After serum-free neural stem cell medium culture and subsequent serum-induced differentiation, cell type, proliferation and differentiation capacities were determined by immunofluorescence staining and flow cytometry. Results At 3-7 days after fluid percussion brain injury, nestin+/GFAP+ cells in the single cell suspension from the model group significantly outnumbered those from the normal control group (P<0.01). In the model group, an increased number of small neurospheres with smooth cell edge and bulged center formed after primary culture, and were clearly visible with the increase of culture time and medium replacement. After several passages, many clonal spheres were obtained, suggesting strong self-proliferatiing capacity. Neurospheres from the model group differentiated into astrocytes, neurons and oligodendrocytes. Conclusion GFAP+/nestin+ cells isolated from the adult rat subventricular zone after fluid percussion brain injury are thought to be neural stem cells because of their self-renewal and multi-differentiation capacities.     

小鼠肌源性干细胞的分离、培养及其分化能力检测

目的探讨小鼠肌源性干细胞(MDSCs)的原代培养方法及其分化潜能,为肌性泌尿组织的细胞修复、治疗奠定基础。方法运用中性蛋白酶(DispaseⅡ)、胰蛋白酶及Ⅰ型胶原酶联合消化法分离小鼠MDSCs,并运用差速贴壁法进行纯化。倒置显微镜下观察细胞形态,RT-PCR法鉴定MyoD及Desmin的表达,同时对分离的细胞进行成骨、成脂等分化诱导并鉴定。结果运用中性蛋白酶可很好地消化组织,差速贴壁法能得到纯度较高的MDSCs;RT-PCR检测发现MDSCs不表达MyoD以及Desmin,提示其为不同于肌卫星细胞的肌源性干细胞;成骨诱导检测碱性磷酸酶(ALP)染色(+),成脂诱导油红O染色(+);其可自体分化诱导为心肌样细胞,免疫荧光法检测心肌肌钙蛋白(cTnI)呈现阳性结果。结论利用此分离方法可获得纯度较高且具有较强分化潜能的肌源性干细胞,有助于进一步进行组织工程研究。