疏水色谱分离人腮腺液蛋白影响因素初探

初步建立了一种分离纯化人腮腺液蛋白的方法。探讨了样品的预处理、不同固定相、流动相以及不同检测波长等因素对正常人腮腺液蛋白疏水色谱分离的影响。结果在４０ｍｉｎ梯度内，以２ｍｏｌ／Ｌ硫酸铵为Ａ流动相，以０．０５ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钾为Ｂ流动相（１００％Ａ∶０％５～０％Ａ∶１００％Ｂ），腮腺液蛋白被分离出６个峰。经生化方法证实，用疏水色谱分离人唾液蛋白的方法，分离度好，保持了蛋白样品的生物活性，且样品处理简单，可成为研究人唾液蛋白成分的一种较理想的方法。     

饮用水中过量氟对儿童唾液蛋白表达的影响

目的　观察分别来自饮用水氟浓度为 3.6 8mg·L-1和 1.0 0mg·L-1两地区儿童间的刺激性颌 /舌下腺唾液中唾液蛋白是否存在差异。方法　测定受试对象的刺激性颌 /舌下腺唾液的唾液流率、唾液总蛋白浓度和单位时间唾液总蛋白的分泌量 ,分析唾液蛋白组成及各组分占总量的比例。结果　①F3 .68组颌 /舌下腺唾液流率高于F1.0 0组 (P <0 .1) ;②F3 .68组颌 /舌下腺唾液总蛋白浓度明显低于F1.0 0 组 (P <0 .0 1) ;③F3 .68组颌 /舌下腺单位时间唾液总蛋白的分泌量显著低于F1.0 0 组 (P <0 .0 5 ) ;④在十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)不连续电泳条件下发现 ,两组颌 /舌下腺唾液共发现 10～ 12条蛋白带 ,其中B10 、B12 蛋白带的出现率在F3 .68组显著低于F1.0 0 组(P <0 .0 5 ) ,且B9蛋白带的量占总蛋白量的比例在F3 .68组显著高于F1.0 0 组 (P <0 .0 1)。结论　两组刺激性颌 /舌下腺唾液中有关唾液蛋白的指标存在量的差异 ,提示饮用水中过量氟对儿童唾液蛋白表达有影响     

全唾液中变异链球菌受体的检测

目的 通过变异链球菌黏结素蛋白和唾液蛋白的相互作用,筛选全唾液中变异链球菌黏结素蛋白的受体成分.方法 变异链球菌国际标准菌株经活化、液体培养,采用冷冻乙醇法提取在液体培养时细菌分泌至培养液中的黏结素,并对黏结素的成分进行电泳分析、含量测定和抗原性检测.选取15名高龋者和15名无龋者,分别于进食后2h采集其无刺激性全唾液,经冷冻干燥后制备电泳样品,采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将其分开,用变异链球菌黏结素蛋白和变异链球菌的抗体成分进行Western-blotting免疫印迹检测.结果 在细菌培养液中提取到了变异链球菌表面分泌的黏结素成分.免疫印迹检测结果显示,唾液中变异链球菌的受体成分至少有6种,不只局限于目前认识的富脯蛋白等3种.结论 变异链球菌表面黏结素可与全唾液中的多种蛋白结合,这有可能是变链菌黏附于牙齿表面的物质基础.     

法国梧桐花粉的部分纯化及其主要变应原免疫活性分析

目的　对法国梧桐花粉变应原进行部分纯化并对其主要变应原免疫活性进行分析。方法　采用凝胶层析法分离纯化法国梧桐花粉变应原 ,经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测收集到的主要峰段的蛋白质分子质量 ,并对 7例法国梧桐花粉过敏支气管哮喘患者血清进行免疫印迹分析。结果　法国梧桐花粉变应原粗制液经SephadexG 10 0层析柱洗脱得两个洗脱峰 ,第一峰及第二峰升段富含蛋白 ;收集各段进行SDS PAGE电泳 ,第一峰升段、峰段、降段电泳图相似 ,主要含分子质量为 2 2～ 71ku之蛋白质 ,第二峰升段以分子质量为 14～ 16ku之蛋白质为主。电泳结果清晰显示 6条蛋白区带 ,分子质量分别为 71、5 0、35、39、2 2、16ku。免疫印迹分析可见 4条sIgG反应带 ,分子质量为 5 0、39、2 2、16ku。结论　法国梧桐花粉变应原含 6种主要蛋白成分 ,第一峰蛋白质含量高 ,为主要致敏组分 ;第二峰蛋白质含量少 ,为次要致敏组分。     

三羟基异黄酮抑制乳腺癌细胞生长的质谱研究

目的 初步研究低浓度的三羟异黄酮对人乳腺癌细胞系MCF-7的生长抑制作用,并通过蛋白质组学方法探讨其分子机制.方法 MCF-7细胞在含25μmol/L三羟异黄酮的培养液中分别培养1～7d后,进行MTT实验,测得生长曲线;采用顺序抽提的方法将细胞总蛋白分级为水溶性和疏水性两个组分,并应用双向电泳方法对其进行分离,以获取蛋白质的表达谱;通过软件分析,找出表达量存在显著差异的蛋白质点;再应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)与生物信息学相结合的方法对差异表达蛋白点进行分析鉴定.结果 25μmol/L的三羟异黄酮对MCF-7细胞具有明显的抑制作用,并在4d后观察到细胞凋亡现象的出现;双向电泳图谱分析表明无论是水溶性蛋白质还是疏水性蛋白都取得了很好的分离,并成功鉴定出24种差异表达蛋白,其中5种下调,19种上调.结论 这些蛋白质的功能涉及了细胞的生长调节、应激反应、形态和凋亡等多个方面.     

适用于细粒棘球蚴囊液蛋白质组分析的双向电泳技术

目的建立适用于细粒棘球蚴囊液蛋白质组的双向电泳分离条件。方法冷冻干燥法制备囊液总蛋白提取物,观察不同的蛋白样品处理方法、IPG胶条pH范围和电泳上样量对双向电泳图谱的影响。结果经ReadyPrepTM2-D Cleanup Kit处理的提取物上样量为400μg,在pH7~10范围的胶条进行双向电泳分离,可获取蛋白斑点较多、重复性较好的二维电泳图谱。结论建立的细粒棘球蚴囊液双向电泳技术及图谱,可为细粒棘球蚴虫蛋白质组学的研究提供理论依据。     

亲和色谱技术在药物分析中的应用进展

亲和色谱是依靠键合在固定相上的配位体与生物活性目标分子间特异性的识别与可逆的亲和作用,实现生物分子选择性分离的一种液相色谱分析方法。该方法具有高选择性、高回收率等特点,可同时进行色谱分离及活性筛选,广泛应用于活性产物的筛选、分离和纯化。本文简述了生物特效亲和色谱、印迹分子亲和色谱、染料配基亲和色谱等几种常用亲和色谱技术,综述了近年来亲和色谱在手性药物拆分、天然药物中活性组分筛选、活性蛋白分离纯化及药物-蛋白相互作用研究中的应用,并对其应用前景进行了展望。     

丹皮药材指纹图谱定性和有效成分定量分析方法研究

目的　建立丹皮药材的反相高效液相色谱定性和定量分析方法。方法　RP HPLCPlanetsilC18分析柱 (15 0mm× 4 .6mm ,5 μm) ,流动相为甲醇 水 冰醋酸 (44∶5 6∶0 .1) ,流速为 1.0mL·min-1,检测波长为 2 4 0nm ,柱温为室温 ,对丹皮药材进行指纹图谱定性分析 ,并对丹皮中的有效成分丹皮酚进行定量测定。结果　在此色谱条件下 ,13份不同丹皮药材的RP HPLC指纹图谱中可检出 11个相对位置稳定的色谱峰 ,通过色谱峰间峰面积的相关性分析 ,可以确定 10个峰可作为定性鉴别的指标峰 ;丹皮药材中丹皮酚含量为 1.32 %～ 2 .78%。结论　丹皮RP HPLC指纹图谱定性和有效成分定量分析方法具有较好的针对性和准确性 ,可用于丹皮药材的质量控制。     

基于鸟枪法蛋白质组学和生物信息学技术对肺鳞癌表达蛋白质谱的分析

目的应用高通量蛋白质组学及生物信息学技术分析肺鳞癌表达蛋白质谱,筛选肺癌标志蛋白质,为肺鳞癌发病机制、早期诊断及治疗提供有价值的线索。方法 6例手术后新鲜肺鳞癌组织,通过激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)分离纯化肿瘤细胞并提取可溶性总蛋白;多维液相色谱-离子阱串联质谱技术(也称鸟枪法蛋白质组学,shot gun proteomics)对蛋白质进行分离、鉴定;进一步通过生物信息学工具预测肺鳞癌细胞表达蛋白质的理化性质、分子功能、生物通路及蛋白质相互作用,并筛选潜在的标志蛋白。结果 LCM共收集了60个帽(cap)的感兴趣细胞,平均每个LCM cap捕获感兴趣细胞数约12000个,其同质性大于95%。可溶性总蛋白经多维液相色谱-离子阱串联质谱共鉴定出860个非冗余蛋白质。蛋白质的理化性质包括分子量、等电点、平均疏水性、跨膜结构域、亚细胞定位、转录后修饰和组织分布等经过在线生物信息学工具分析,并通过统计图直观显示;蛋白质生物学功能基于Gene Ontologyc(GO)软件和Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)生物学通路分析,根据其注解,筛选出3个有价值的蛋白质,即分裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、粘联素A1(annexin A1,ANXA1)、高移动组蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGPB1)可以作为肺鳞癌候选的标志蛋白。结论鸟枪法蛋白质组学可大规模分离、鉴定肿瘤细胞表达蛋白质,基于生物信息学筛选的标志蛋白质可能成为肺癌诊断和治疗的分子靶点。     

“鸟枪”蛋白组学技术鉴定牙龈卟啉单胞菌47A-1亚型外膜蛋白

目的利用shotgun(鸟枪)蛋白质组学策略鉴定牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)亚型47A-1外膜蛋白,深化P.g外膜蛋白的蛋白质组学研究,为进一步研究P.g外膜蛋白的致病性奠定基础。方法提取P.g47A-1外膜蛋白,SDS-PAGE电泳分离蛋白,胶内酶解为多肽混合物,应用毛细管高效液相色谱加串联质谱分析,SEQUEST程序进行数据库搜索并鉴定蛋白。结果用考马斯亮蓝法染色凝胶分离的蛋白,发现P.g47A-1蛋白条带主要在14.3~97 ku之间。酶解的肽段经毛细管高效液相色谱分离,得到肽段水平的总离子流图,分析肽段序列后发现P.g47A-1蛋白有623个唯一肽段,鉴定出136种蛋白,包括了51种已知蛋白,85种未知蛋白。结论 Shotgun技术可分析出P.g47A-1大量未知蛋白,尤其是丰度低、疏水性强的外膜蛋白,优于二维凝胶电泳(two dimensional gelelectrophoresis,2-DE)等传统蛋白质组学方法,为进一步研究P.g外膜蛋白的致病性奠定了基础。     

126例涎腺肿瘤的免疫组织化学研究

利用S-100蛋白抗体对126例涎腺肿瘤（多形性腺瘤、恶性多形性腺瘤、粘液表皮样癌、腺样囊性癌、基底细胞腺瘤和乳头状囊腺瘤等）进行了免疫组化研究。结果发现:5种肿瘤中都有瘤细胞或部分瘤细胞表达S-100蛋白;但乳头状囊腺瘤的肿瘤性上皮则呈S-100蛋白阴性反应。提示:S-100蛋白抗原在涎腺肿瘤性肌上皮细胞中均有表达。     

涎腺肿瘤组织中人乳头瘤病毒DNA的检测

为探讨腺上皮起源的涎腺良、恶性肿瘤与人乳头瘤病毒（Ｈｕｍ ａｎ ｐａｐｉｌｌｏ ｍ ａｖｉｒｕｓ, ＨＰＶ）感染的关系,应用聚合酶链反应技术（ＰＣＲ）,采用共有引物检测４４例涎腺肿瘤组织中的ＨＰＶ ＤＮＡ的存在状况。１０ 例正常涎腺组织作为对照。结果显示：肿瘤组织中ＨＰＶ ＤＮＡ 阳性检出率达７０．４５％ （３１／４４）,其中恶性肿瘤 ＨＰＶＤＮＡ 阳性率为７７２７％ （３１／４４）;良性肿瘤ＨＰＶＤＮＡ阳性率为６３６３％ （１４／２２）;而正常对照组织中ＨＰＶ ＤＮＡ阳性率仅为１０％ （１／１０）。提示：涎腺肿瘤的发生可能与ＨＰＶ感染有关     

THE ADHERENCE OF CARIOGENIC BACTERIA TO PELLICLE FORMED IN VITRO FROM MIXED AND DELIPIDATED SALIVA

Ｓａｌｉｖａｒｙｌｉｐｉｄｓ,ａｓａｓｏｒｔｏｆｏｒｇａｎｉｃｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｓａｌｉｖａ ,ｐｌａｙａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｏｒａｌｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄｐａｔｈｏｌｏｇｙ .Ｔｈｅｐｒｅｖｉｏｕｓｓｔｕｄｉｅｓａｂｏｕｔｓａｌｉｖａｒｙｌｉｐｉｄｓｆｏｃｕｓｅｄｏｎｉｔｓｏｒｉｇｉｎ ,ｉｔｓｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈｃａｒｉｅｓａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌｙｃｏｐｒｏ ｔｅｉｎ[1-3 ] .Ｂｕｔｔｈｅｒｅａｒｅｆｅｗｓｔｕｄｉｅｓｏｎｓａｌｉｖ…     

涎腺肿瘤中Survivin蛋白的表达及意义

目的探讨涎腺肿瘤中Survivin蛋白的表达情况,明确其表达与涎腺肿瘤的发生、发展及临床病理的关系。方法制备组织芯片,应用pictureTM法进行免疫组化染色。结果①Survivin蛋白在涎腺良性肿瘤中的阳性表达率显著低于交界性肿瘤、恶性肿瘤及癌旁腺体中的表达(P均<0.005);交界性肿瘤与恶性肿瘤中的表达无显著性差异(P>0.05);而恶性肿瘤中的表达高于癌旁腺体中的表达,且差异有显著性(P<0.01)。②在恶性肿瘤中,低分化者的Survivin阳性表达率明显高于高分化者(P<0.0005);有淋巴结转移者明显高于无淋巴结转移者(P<0.0005);复发瘤明显高于原发瘤(P<0.05);而不同性别、年龄及不同大小的肿瘤间均无显著性差异(P>0.05)。结论Survivin蛋白表达与涎腺恶性肿瘤的发生、发展及预后有关,可作为涎腺恶性肿瘤早期诊断及预后判断的可靠指标。     

人B7.2(CD86)胞外区原核表达及其工程菌发酵培养的实验研究

目的　利用原核系统表达人B7.2 (IgV +C)并对工程菌发酵培养条件进行优化。方法　用聚合酶链反应 (PCR)技术从B7.2cDNA全长中克隆B7.2 (IgV +C) ,将PCR产物克隆入表达载体 pGEX 4T 3从而得到重组体 pGEX 4T 3 /hB7.2 (IgV +C) ,SDS PAGE及Westernblot用于检测目的蛋白的表达 ,同时对目的蛋白诱导表达时间及诱导剂浓度进行优化 ,对重组质粒的遗传稳定性进行鉴定。结果　Westernblot结果显示相应分子质量 5 5kD处有hB7.2 (IgV+C)与GST融合蛋白的高效表达 ,表达量占菌体总蛋白的 3 0 %左右。对工程菌进行发酵培养研究的结果表明 ,所构建的重组质粒在工程菌DH5α中传代稳定 ,未见质粒丢失 ,目的蛋白的表达不受影响 ,且在 3 7℃诱导 5h、IPTG终浓度为 4mmol·L- 1 时其表达量最多。结论　证明了利用原核系统表达人B7.2 (IgV +C)的可行性。     

涎腺粘液表皮样癌中角蛋白、波形蛋白和S-100蛋白的定位研究

用免疫组化法对37例涎腺粘液表皮样癌中角蛋白、波形蛋白和S-100蛋白定位进行观察,发现表皮样细胞和中间细胞呈角蛋白、波形蛋白和S-100蛋白阳性,粘液细胞呈角蛋白和S-100蛋白阳性。肿瘤团块中有些散在梭形、星形或不规则形细胞呈S—100蛋白强阳性;囊腔和腺管腔面细胞基部也有梭形、扁平或不规则形细胞呈S-100蛋白强阳性及波形蛋白和角蛋白阳性。在肿瘤细胞索外周还发现些梭形或扁平细胞是S-100蛋白、波形蛋白和角蛋白阳性。提示,涎腺粘液表皮样癌为上皮源性肿瘤,实质内存在肌上皮细胞,肌上皮细胞与中间细胞似有直接关联。     

IN VITRO CO-STIMULATORY ACTIVITY OF HUMAN B7.2(IgV+C)PROTEIN PRODUCED BY ENGINEERED BACTERIA

It was well known that "two signals" wereboth necessary to activate T lymphocytes. The firstsignal was provided by TCR--CD, which was en-gaged with antigen peptide--MHC complex, and thesecond, also named the costimulatory signal, wasprovided by the interaction between costimulatorymolecules B7. l and B7. 2 on antigen presenting celland its counter--receptor CD28/CTLA4 on T cell.The first signal alone without costimulation willlead T cell to anergy or apoptosis['~'2. B7. 2 mayplay a cri…