β淀粉样前体蛋白裂解酶特异性小干扰RNA真核表达载体的构建和鉴定

目的构建β淀粉样前体蛋白裂解酶(BACE)特异性小干扰RNA真核表达载体。方法用PCR扩增BACE特异性小干扰RNA,转入带有增强型绿荧光蛋白(EGFP)和启动子U6的pUC19质粒,再将重组基因片段导入逆转录病毒真核表达载体pLXSN中,通过限制性酶切对该重组表达载体进行鉴定。结果成功构建了BACE真核表达载体pLXSN/EGFP-U6-siBACE。结论pLXSN/EGFP-U6-siBACE载体的成功构建对进一步利用基因干扰技术治疗阿尔茨海默病的研究奠定了重要的基础。     

转化生长因子-β1基因RNAi质粒载体的构建与鉴定

目的 构建人转化生长因子-β1(TGFβ1)基因RNAi质粒载体.方法 根据人TGFβ1 mRNA序列选择3个靶序列并设计合成相应3对寡核苷酸序列,同时合成1对阴性对照寡核苷酸序列;将以上4对寡核苷酸序列退火后连入pRNA-U6.2/Lenti质粒并分别命名为pRNA-U6.2/Lenti-1、pRNA-U6.2/Lenti-2、pRNA-U6.2/Lenti-3、pRNA-U6.2/Lenti-4.酶切和测序鉴定后,将以上重组质粒转染Hela细胞,运用RT-PCR和ELISA检测TGFβ1 mRNA和蛋白的表达水平.结果 酶切和测序证实目的 寡核苷酸片段已被准确克隆到pRNA-U6.2/Lenti质粒;与对照组相比,pRNA-U6.2/Lenti-1、pRNA-U6.2/Lenti-2转染Hela细胞后,TGFβ1 mRNA水平及蛋白水平的表达量均受到明显抑制;其中TGFβ1蛋白水平在pRNA-U6.2/Lenti-1组下降79.2%,在pRNA-U6.2/Lenti-2组下降53.7%,统计有显著性差异(P＜0.01).结论 成功构建了人TGFβ1基因RNAi质粒载体,对于TGFβ1高表达疾病的基因治疗奠定了基础.     

大鼠PER2基因RNAi慢病毒载体的构建及干扰效率的测定

目的构建及筛选有效干扰大鼠血管平滑肌细胞PER2基因的shRNA慢病毒载体,并测定其干扰效率。方法设计大鼠PER2的siRNA靶序列,插入慢病毒载体质粒pGLV-U6-EGFP中,构建pLentivirus-per2-rat表达重组体并转染至A7r5大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞内,利用Real-time PCR方法检测PER2基因的mRNA表达水平,筛选有效沉默钟基因PER2表达的RNAi慢病毒载体。结果经电泳、基因测序证实插入的目的序列正确,有PER2表达,成功构建了pLentivirus-per2-rat表达重组体;转染慢病毒载体pLentivirus-per2-rat至A7r5大鼠胸血管平滑肌细胞,测定转染效率达70%;Real-time PCR检测PER2基因的mRNA相对表达量,筛选出有效干扰大鼠血管平滑肌细胞钟基因Per2表达的siRNA片段,使PER2mRNA表达量下调约84%。结论成功构建了大鼠PER2的RNAi慢病毒载体,为进一步研究时钟基因的功能奠定了基础。     

硒蛋白S截短和全长重组质粒的构建与表达

目的构建截短和全长硒蛋白S(SelS)重组体,以期在细胞系中或动物体内高表达并观察其生物学效应。方法用基因重组技术构建SelS的截短体和全长的重组质粒,截短体基因只包含mRNA的编码序列(CDS),全长包括mRNA的CDS和3′非翻译区(UTR)序列,此序列中含硒代半胱氨酸的插入序列(SECIS)。将重组质粒送公司测序并比对。用脂质体2000将硒蛋白SelS质粒转染至细胞中,24h后观察绿色荧光蛋白的表达,流式细胞技术检测细胞的转染效率;收集细胞用Trizol法提取总RNA,将mRNA反转录为cDNA,以此为模板用PCR扩增以观察目的基因的表达。结果测序结果显示重组序列与目的基因完全一致,质粒构建成功。显微镜下可观察到细胞高表达绿色荧光蛋白,经流式细胞技术验证细胞的转染效率达到40%以上。PCR产物的凝胶电泳结果显示:与对照组及其他实验组相比,只有转染了目的基因的实验组高表达截短和全长的SelS基因。结论成功构建SelS截短的和全长的重组质粒并转染入细胞中高表达,对观察硒蛋白截短体和完整形式在细胞系或动物体内的生物学效应提供了基础。     

pEGFP-N1-TNFα表达载体的构建与鉴定

目的构建pEGFP-N1-TNFα重组质粒并鉴定,为转导CIK细胞并定位表达奠定基础。方法以pMD19Sim-ple T-TNFα为模板,PCR扩增TNFαCDS区片段,将PCR产物进行15g/L琼脂糖凝胶电泳,并回收TNFα条带,用BglⅡ和HindⅢ将TNFα的PCR片段及目的载体pEGFP-N1双酶切,然后进行连接。连接产物转化至DH5α中。挑取克隆,提质粒,进行鉴定。结果 PCR扩增片段、双酶切出现722bp大小的目的基因条带与预期结果相符;插入片断测序结果与合成的寡核苷酸序列一致。结论成功构建了重组质粒pEGFP-N1-TNFα,为下一步用纳米材料转染CIK细胞的研究奠定了基础。     

人U_6启动子表达载体的构建及在胃癌细胞中的活性鉴定

目的构建人U6(hU6)snRNA启动子驱动的小RNA分子的表达载体,并在人胃低分化腺癌SGC-7901细胞中鉴定其表达外源性小RNA分子的活性。方法以人基因组DNA为模板,用PCR方法扩增hU6snRNA启动子序列,并将其克隆入PUC19载体中,命名为PUC-hU6-extra,经测序证明其序列的正确性;用脂质体法转染SGC-7901细胞;用RT-PCR检测U6启动子的转录活性,并测定培养细胞的生长曲线。结果hU6snRNA基因启动子和紧接转录起始点hU6snRNA的前27个核苷酸被成功地克隆入PUC19质粒载体,重组载体在SGC-7901细胞中能高表达小分子RNA,并且未观察到后者对细胞体外增殖的影响。结论成功构建了以hU6snRNA启动子驱动的、能在人胃低分化腺癌SGC-7901细胞内高效转录小分子RNA的表达质粒PUC-hU6-extra。     

携带CIP2A shRNA重组腺相关病毒载体的构建及其鉴定

目的构建携带CIP2AshRNA重组腺相关病毒载体,制备靶向性沉默CIP2A表达的高浓度重组腺相关病毒。方法设计合成CIP2AshRNA,退火形成双链与pDC316-EGFP-U6质粒BamHⅠ和HindⅢ双酶切产物相连接构建形成质粒pDC316-EGFP-CIP2AshRNA,以鉴定正确的pDC316-EGFP-CIP2AshRNA克隆为模板PCR扩增EGFPCIP2AshRNA片段,EcoRⅠ和SalⅠ双酶切PCR扩增产物及pSNAV2.0质粒后进行连接形成重组质粒pSNAV2.0-EGFP-CIP2AshRNA,建立载体细胞株BHK/CIP2A-shRNA,采用AAV MaxTM包装系统大规模制备rAAV2-EGFPCIP2AshRNA并对其纯化及滴度测定。将rAAV2-EGFP-CIP2AshRNA感染肝癌细胞HepG2,利用空载病毒载体rAAV2-EGFP作对照,采用Real-time PCR及Western blot方法检测CIP2AshRNA基因沉默效果。结果携带编码CIP2AshRNA腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-EGFP-CIP2AshRNA经双酶切及测序鉴定,质粒构建正确;将重组质粒与辅助病毒HSV1-rc/ΔUL2共转染包装细胞BHK-21,成功制备重组腺相关病毒rAAV2-CIP2AshRNA,经测定纯化所得rAVV2病毒滴度为0.25×1012v.g./mL。筛选MOI值为1×105感染肝癌细胞HepG2,CIP2A mRNA及蛋白表达水平分别于感染后24h和48h与对照细胞相比出现明显下降。结论成功制备高滴度携带CIP2AshRNA重组腺相关病毒载体rAAV2-CIP2AshRNA。     

RNA结合蛋白La对宫颈癌细胞侵袭转移的影响及其机制

目的探讨RNA结合蛋白La(La)对宫颈癌细胞侵袭转移的作用及其作用机制。方法采用RNA干扰技术沉默La基因在宫颈癌细胞株HeLa中的表达,并通过G418筛选,构建稳定表达的HeLa的La干扰克隆。采用划痕实验、Transwell小室等检测La对宫颈癌细胞侵袭转移的影响。利用Western blot的方法检测细胞中基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶抑制剂2(TIMP-2)的表达,并采用明胶酶谱的方法检测细胞培养上清中MMP-2的活性。结果 La干扰后细胞的迁徙和侵袭能力明显降低,对细胞迁徙距离和穿过Transwell小室的细胞数目进行分析后发现,差异有统计学意义;同时发现在细胞中MMP-2的蛋白表达水平及酶活性均降低,而TIMP-2的蛋白表达水平上调。结论 La对宫颈癌的侵袭转移具有促进作用,这种作用可能与其对基质金属蛋白及其抑制剂的调控相关。     

Nucleostemin基因特异性RNA干扰对胃癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨应用RNA干扰技术抑制nucleostemin(NS)基因表达对胃癌SGC-7901细胞株增殖和凋亡的影响.方法 阳离子脂质体法将构建好的NS siRNA表达载体转染胃癌SGC-7901细胞株,采用MTT法测试各组细胞增殖抑制率;RT-PCR法检测各组细胞NS基因表达情况,流式细胞术检测细胞周期,Annexin V FITC/PI法检测细胞凋亡率.结果 与对照组相比,S组细胞的增殖减慢,24、48、72h细胞增殖抑制率分别为53.21%、71.54%、87.47%;NS基因表达量下降,G0/G1期细胞百分率显著升高(58.34%),S期细胞减少(20.68%),细胞凋亡率增加(26.85%).结论 RNA干扰技术可抑制胃癌SGC 7901细胞株NS基因的表达,使细胞增殖减慢,细胞周期阻滞在G0/G1期,凋亡率增加.     

靶向沉默巨噬细胞中Mcl-1基因shRNA表达质粒的构建与鉴定

目的研究髓样细胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)基因在小鼠巨噬细胞Raw264.7和人巨噬细胞THP-1中的表达情况,筛选出表达含量高的细胞株作为实验用细胞,根据筛选的结果构建靶向小鼠Mcl-1基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒进行转染,最后筛选出沉默Mcl-1基因效果最明显的shRNA表达质粒。方法利用半定量RT-PCR和蛋白质免疫印迹(Western blotting)分别检测两种巨噬细胞中Mcl-1mRNA和蛋白表达情况。采用小分子干扰RNA(siRNA)软件设计3个针对Mcl-1基因不同位点的shRNA片段,由公司构建携带此shRNA片段的真核表达质粒(Mcl-1shRNA1-3),然后通过脂质体将真核表达质粒载体转染到小鼠巨噬细胞株Raw264.7中,24、48h后通过倒置荧光显微镜观察转染效果,并分别采用实时定量PCR和Western blot检测Mcl-1mRNA和蛋白表达情况。结果小鼠巨噬细胞Raw264.7中Mcl-1的mRNA及蛋白质的表达显著高于人巨噬细胞,差异有统计学意义(P<0.05);构建的shRNA表达载体在24、48h均能降低Raw264.7细胞内mcl-1mRNA和蛋白水平,尤其在48h沉默效果最为明显;转染48h后与正常组、脂质体组和阴性对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);与Mcl-1shRNA1和Mcl-1shRNA2相比,Mcl-1shRNA3对Mcl-1mRNA和蛋白的沉默作用最强。结论成功筛选出了实验所用细胞Raw264.7及对小鼠巨噬细胞Raw264.7内Mcl-1具有明显沉默效果的靶向Mcl-1shRNA3真核表达质粒。     

反义HSP70真核表达载体的构建和在人喉癌细胞的表达

目的　进行促凋亡治疗喉癌实验 ,构建和鉴定携带反义HSP70 (heatshockprotein 70 )基因的真核表达载体。方法　将HSP70cDNA反向克隆入 pcDNA 3.1,构建CMV启动子控制的真核表达载体 pcDNA AHSP70 ,用酶切鉴定结果 ;应用该载体转染人喉表皮样癌细胞Hep 2 ,G4 18筛选阳性克隆 ;westernblot和免疫组化检测转染前后瘤细胞的HSP70的表达。检测转染前后瘤细胞的生物学性状。结果　获得 pcDNA AHSP70真核表达载体 ,HSP70反义RNA阻断了Hep 2细胞的HSP70的表达 ,经westernblotting和免疫组化证实 ,实验组瘤细胞不能表达或低表达HSP70 ,而对照和空载体组高表达HSP70。转染反义HSP70的真核表达载体的Hep 2细胞比空载体组和对照组的细胞生长缓慢 ,细胞周期可见实验组出现亚二倍凋亡峰 ,而空载体组没有。结论　本研究成功构建了反义HSP70真核表达载体并在人喉癌细胞得以表达。     

短发卡RNA抑制survivin表达并诱导CNE-2细胞凋亡

目的观察以短发卡RNA(shRNA)抑制鼻咽癌细胞survivin表达对细胞凋亡与增殖的影响。方法构建特异性survivin shRNA,转染CNE-2细胞。分组:A组为空白对照组;B组为阴性干扰组,转染pSIREN-survivin/nonsenseshRNA;C组为阳性干扰24h组,转染pSIREN-survivin/shRNA;D组为阳性干扰48h组,转染pSIREN-survivin/shRNA。以RT-PCR、Western-blot分别测定细胞survivin mRNA及蛋白,PI、TUNEL及MTT检测细胞周期、凋亡率、细胞增殖。结果转染效率约(70.90±4.76)%;C组survivin mRNA和蛋白抑制率分别为(41.58±0.63)%、(68.29±0.52)%;D组抑制率分别为(63.64±0.96)%、(70.83±0.48)%。C组凋亡率为(36.24±0.78)%,D组为(50.37±0.85)%,显著高于B组和A组;S期细胞减少,G2/M期比例增高;MTT结果提示细胞增殖受到明显抑制。结论特异性shRNA可有效干扰CNE-2内survivin的表达,诱导细胞凋亡并抑制其过度增殖。     

丙型肝炎病毒NS3-NS4基因的表达及鉴定

目的　构建丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS3 NS4全长基因重组质粒并诱导表达 ,鉴定NS3 NS4蛋白的抗原性。方法　应用PCR技术从pUC19/HCV中扩增目的基因 ,构建重组表达质粒 ,进行原核表达 ,用SDS PAGE、ELISA技术对表达产物的抗原性进行鉴定。结果　成功构建、表达了重组质粒pBV2 2 0 /NS3 NS4 ,用 5 0份质控标准血清对表达蛋白质进行抗原性检测 ,与第二代诊断试剂相比 ,总符合率为 96 %。结论　全长NS3 NS4蛋白是一个优势免疫原性区 ,应该是HCVEIA诊断试剂的有效成分。     

一种改良式质粒DNA提取方法的建立与应用

目的建立一种稳定、可靠的质粒DNA提取改良方法,探讨其在分子生物学实验研究中的应用价值。方法将含有目的质粒的菌株扩增后,运用改良后的碱裂解法进行质粒DNA小量提取,微量核酸仪测定提取质粒DNA的产量及纯度;采用琼脂糖凝胶电泳、内切酶酶切及质粒转染真核细胞鉴定提取质粒DNA的质量及转染效率。结果改良式质粒提取方法获得质粒DNA产量为3.2 mg/L菌液,A260/280=1.91;内切酶酶切完全;质粒DNA以超螺旋结构为主;真核细胞转染效率为20%左右。结论改良式质粒DNA抽提方法操作简单、实用,获得质粒DNA产量多、质量高,能达到分子生物学常规实验的要求。     

Fas和Bcl-2蛋白在人脑星形细胞瘤中的表达及意义

目的　研究Fas及Bcl 2蛋白在人脑星形细胞瘤中的表达特点和相互关系 ,为预后评估及治疗提供理论依据。方法　收集人脑星形细胞瘤标本 5 1例 ,非肿瘤患者的正常脑组织 10例。标本均行HE染色与SP免疫组织化学染色。分析Fas及Bcl 2蛋白表达程度与星形细胞瘤恶性分级的关系。结果　正常脑组织未见Fas蛋白表达 ,只有 1例表达Bcl 2蛋白 ,且表达程度非常弱。星形细胞瘤均有Fas及Bcl 2蛋白的表达 ,并且表达率及表达强度随着星形细胞瘤级别的增高而增强。Fas蛋白表达阳性的肿瘤中Bcl 2蛋白表达率 (6 8.6 % )显著高于Fas蛋白表达阴性的肿瘤 (43.8% )。结论　Fas和Bcl 2蛋白可能与星形细胞瘤的发生和发展有较密切的关系 ,且它们在星形细胞瘤的发生中可能存在相互作用的关系。Fas及Bcl 2蛋白在星形细胞瘤中的表达 ,对疾病预后评估及针对性免疫治疗具有一定的临床价值。     

浅谈公路施工中的工程质量管理问题

公路的设计标准和工程质量要求高,必须重视和加强公路现场施工中的工程质量管理问题。本文从提高全员质量意识、重视工地试验室建设、重视现场跟踪检查、采取有效的质量奖罚措施等方面阐述了公路现场施工中的质量管理问题。     

公路建设与生态工程建设

宏观分析了公路建设对沿线生态环境的影响,并提出了实施交通生态工程建设的措施和意义。     

矮塔斜拉桥施工状态下结构损伤识别研究

以广东省江肇高速公路西江特大桥为工程背景,选取最大双悬臂施工状态,采用MIDAS软件获取损伤状态下的各阶模态,将模态信号导入MATLAB中进行了Hilbert-Huang变换和小波变换,对结构损伤状况进行了识别判断,并对比了两种识别方法的识别效果.研究结果表明:Hilbert-Huang变换方法损伤识别效果良好,抗噪性强,但存在端点效应问题;小波变换方法损伤识别效果与所选小波基有关,不利于基准的选取,且小波识别需要消噪,消噪可能会导致损伤漏检.     

土工格栅的施工方法及注意事项

结合大庆市区公路建设施工的经验 ,介绍了土工格栅的作用及适用的条件。如在路堤加筋、台背路堤填土加筋、岩石边坡路基防护和路面裂缝的防治等。     

钻孔灌注桩施工监理

着重介绍钻孔灌注桩施工监理事项、监理要点、施工监理方法、监理流程及桩基质量检验的标准。