MMP-2/TIMP-2系统与原发性开角型青光眼的相关性分析

目的 探讨基质金属蛋白酶-2/金属蛋白酶组织抑制因子-2(MMP-2/TIMP-2)系统在原发性开角型青光眼中的可能发病机制.方法 正常人尸眼20只,中期原发性开角型青光眼患者20只眼,晚期原发性开角型青光眼22只眼,均行常规小梁切除术,采用RT-PCR法检测小梁网组织中MMP-2 mRNA和TIMP-2 mRNA的表达.结果 正常人和中、晚期原发性开角型青光眼小梁网均有MMP-2 mRNA和TIMP-2 mRNA的表达;MMP-2 mRNA在正常人小梁网呈高表达,在原发性开角型青光眼中表达明显下调,且随病程发展其表达逐步降低;TIMP-2 mRNA在正常人小梁网呈低表达,在原发性开角型青光眼中表达明显上调,且随病程发展其表达逐步升高;原发性开角型青光眼小梁网MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值明显低于正常人,且随病程发展比值逐步减小.结论 小梁网细胞外基质TIMP对MMP的异常抑制,造成MMP-2/TIMP-2系统的失衡,可能是原发性开角型青光眼的发病机制之一.     

Alendronate affects osteoprotegerin/receptor of activator of nuclear factor κB-ligand expression in human marrow stroma cells in vitro

Objective To evaluate the effect of alendronate on osteoprotegerin (OPG) and receptor of activator of nuclear factor κB-ligand (RANKL) expression in human marrow stroma cells (hMSCs) in vitro. Methods hMSCs were isolated from haman marrow, cultured in vitro, and randomly divided into two groups: alendronate group, hMSCs culture fluid containing 1×10-7 mol/ L alendronate; control group, no special treatment but culturing hMSCs in DMEM. Two weeks after treatment, the expressions of OPG and RANKL were evaluated by RT-PCR and Western blot.Results hMSCs became uniform spindle-shaped fibroblasts. As cells proliferated, they formed colonies and showed whirlpool arrangement. After one week's treatment, hMSCs in alendronate group had reduced processes and gradually showed disc shape, which did not happen in control group but kept fibroblast shape and just increased in density. In RT-PCR, the ratio of OPG/RANKL in alendronate group and control group was 8.77±1.16 and 4.58±1.27, respec-tively. In Western blot, the ratio of OPG/RANKL in alendronate group and control group was 2.58±0.47 and 1.52±0.32, respectively. The ratio of OPG/RANKL was higher in alendronate group than in control group (P<0.01).Conclusion Alendronatc enhances OPG expression and inhibits RANKL expression of hMSCs in vitro.     

SD、E3与DA1U大鼠视网膜光损伤敏感性的差异研究

目的比较SD、E3与DA1U大鼠视网膜光损伤敏感性,为构建不同品系大鼠视网膜光损伤模型和研究眼底色素抗光损伤保护视网膜的相关机制研究提供实验依据。方法成年SD、E3、DA1U大鼠,雌雄随机选取,采用视网膜电图与HE染色分别检测正常情况下与光损伤后不同品系大鼠视网膜感光功能与组织形态变化,采用TUNEL染色观察光损伤后视网膜凋亡细胞的分布与数量。结果正常状态下,SD大鼠色素上皮层、脉络膜层及E3大鼠色素上皮层均无色素分布,而E3大鼠脉络膜层、DA1U大鼠色素上皮层与脉络膜层有褐色色素分布;HE结果显示,在正常状态下,3种品系大鼠视网膜外核层厚度没有显著差异,而在光损伤条件下,SD大鼠视网膜各层细胞均严重受损;视网膜电图结果显示,在正常状态下,不同品系大鼠间视网膜电图视杆细胞反应b波振幅存在显著差异,E3大鼠最大混合反应a波及b波振幅与SD大鼠相比有显著差异,而在光损伤条件下,与SD大鼠相比,E3和DA1U大鼠视网膜电图a波与b波的波幅降幅显著减弱;TUNEL染色结果显示,与SD大鼠相比,E3与DA1U大鼠视网膜内核层及外核层凋亡细胞分布范围与数量均显著下降。结论 SD、E3与DA1U大鼠间存在视网膜色素分布与光损伤敏感性的差异,分布于脉络膜与色素上皮层的色素可能在大鼠抗视网膜光损伤过程中起到重要作用。     

C57/BL6小鼠海马结构发生、发育和衰老过程中的细胞凋亡

目的探讨C57/BL6小鼠海马结构发生发育及衰老过程中细胞凋亡的变化规律。方法采用Hoechst 33258染色检测不同阶段C57/BL6小鼠海马结构中的细胞凋亡;免疫荧光和Western blotting技术检测不同阶段C57/BL6小鼠海马结构中Caspase-3的表达。结果 Hoechst 33258染色结果显示:胚龄(embryonic day,E)12d～18d凋亡细胞渐增多;生后(postnatal day,P)1～7d渐减少;P14d～2月主要于齿状回、海马沟和海马槽的白质区可见少量凋亡细胞;3月～18月仅在齿状回亚颗粒细胞层见零星分布。阿蒙角(Ammons horn,CA)及齿状回(dentate gyrus,DG)多形层及分子层细胞凋亡率P1～P14d渐下降。CA及DG主细胞层细胞凋亡率P1d最高,以后逐渐降低。Caspase-3免疫荧光结果示:E12～E16d阳性表达细胞渐增多;E18～P3d继续增多,主要分布于CA锥体层及DG颗粒层;P5～P14d分布渐减少;P21d～18月各区仅见少量阳性细胞表达。Western Blotting结果示E18～P3dCaspase-3表达增加;P5～P21d表达降低;P21d后趋于稳定。结论生后1d为小鼠海马结构凋亡高峰;Caspase-3为重要凋亡因子。     

缺血预处理对大鼠小肠移植后肠黏膜的保护作用

目的探讨缺血预处理(ischemic preconditioning,IPC)对缺血-再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)大鼠肠黏膜屏障的保护作用。方法建立SD大鼠小肠移植模型;实验分为3组(n=8):假手术组(S)、缺血-再灌注组(I/R)组和缺血预处理组(IPC);观察小肠病理组织形态学变化,检测比较各组大鼠肠黏膜丙二醛(malondialchehyche,MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)的活性以及肠黏膜细胞凋亡发生率与分布及其凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达变化。结果与I/R组相比,IPC大鼠小肠组织病理形态学明显改善(P<0.05),肠组织MDA含量和MPO活性均显著降低(P<0.05),而SOD活性则明显升高(P<0.05);肠黏膜细胞凋亡率明显下降(P<0.05);凋亡相关蛋白Bcl-2表达明显增加(P<0.05);而Bax蛋白表达明显减少。结论 IPC可减轻移植大鼠I/R损伤,与抗氧化作用增强和小肠肠黏膜细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达调控而抑制肠黏膜细胞凋亡有关。     

黄芪总皂苷对瘦素诱导的HSC增殖和TIMP-1上调的影响

目的观察黄芪总皂苷对瘦素诱导的肝星状细胞(HSC)增殖及组织抑制基质金属蛋白酶-1(TIMP-1)分泌的影响。方法培养HSC,分为溶媒组、溶媒瘦素组和黄芪总皂苷组。磺酰罗丹明B法检测HSC增殖,利用2,7-二氯二氢荧光素二乙酯作为探针检测HSC中的活性氧水平,酶联免疫吸附实验测定HSC培养液中TIMP-1含量。结果黄芪总皂苷50、100、200μg/mL与溶媒瘦素组相比,明显抑制瘦素诱导的HSC增殖(P<0.01),抑制率分别达29.1%、66.7%和86.1%,同时能够抑制瘦素诱导HSC的活性氧产生(P<0.05)以及TIMP-1的分泌(P<0.05)。结论黄芪总皂苷可能通过下调瘦素诱导的氧化应激水平,从而抑制HSC增殖以及TIMP-1的分泌。     

hTERT转染永生化新生大鼠耳蜗基底膜细胞的研究

目的通过基因转染法获得新生大鼠耳蜗基底膜细胞永生化细胞系。方法通过脂质体法将pCI-neo-hTERT质粒转染原代培养的新生大鼠耳蜗基底膜细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞系,并行转染细胞RT-PCR、端粒酶活性、细胞周期、细胞凋亡等检测。结果转染72h后RT-PCR检测到人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因阳性表达,转染细胞通过G418筛选传代后,可检测到端粒酶活性,流式细胞术检测提示转染细胞增殖活力增强不明显,但细胞凋亡明显减少。结论通过脂质体转染hTERT基因,可使新生大鼠耳蜗基底膜细胞凋亡减少,传代能力增强,给耳蜗细胞实验提供足够的细胞来源。     

survivin-siRNA质粒的构建及其抑制survivin基因在Hela细胞中的表达

目的 合成、克隆、筛选survivin-siRNA干扰片段,构建含有survivin-siRNA的骨架质粒,明确其抑制survivin基因在Hela细胞中表达.方法 利用RNA干扰方法构建真核表达载体pGenesill.1-survivin-siRNA.体外培养人宫颈癌Hela细胞,利用脂质体法将该质粒转染Hela细胞.利用Western blot法检测该质粒转染后survivin基因的表达,筛选最佳干扰质粒.通过MTT法检测Hela细胞的生长.通过流式细胞学技术检测细胞凋亡率.结果 成功构建及筛选出survivin-siRNA质粒.MTT实验及流式细胞学实验'证实该质粒体外能够有效诱导细胞凋亡.结论 成功构建survivin-siRNA质粒,为今后应用该质粒进行宫颈癌的基冈治疗提供了实验基础.     

血红素加氧酶-1基因修饰的骨髓间质干细胞抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的实验研究

目的 探讨骨髓间质干细胞携带的血红素加氧酶-1(HO-1)基因于体外共培养体系中抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的效果及机制.方法 采用核转染技术将HO-1质粒转染至骨髓间质干细胞,共培养肺动脉平滑肌细胞和骨髓间质干细胞,评估5-羟色胺刺激后的平滑肌细胞增殖情况,检测5-羟色胺刺激后平滑肌细胞中RhoA的活性.结果 5-羟色胺可刺激肺动脉平滑肌细胞增殖,使单纯培养的平滑肌细胞总数较对照组增加2.40倍(P<0.01).野生型骨髓间质干细胞与肺动脉平滑肌细胞共培养并不能抑制平滑肌细胞的增殖,而携带HO-1基因的干细胞则可明显抑制5-羟色胺刺激的平滑肌细胞增殖,使平滑肌细胞总数降至对照组的1.56倍(P<0.05);5-羟色胺可引起肺动脉平滑肌细胞中RhoA活性增加2.90倍,野生型干细胞与肺动脉平滑肌细胞共培养并未能改变5-羟色胺刺激的RhoA激活,但在携带HO-1基因的干细胞共培养体系中5-羟色胺诱发的RhoA活性明显降低.结论 骨髓间质干细胞携带的HO-1基因可以旁分泌的形式抑制平滑肌细胞的增殖,其作用的机制可能与其产生的CO通过激活cGMP信号通路进而抑制RhoA的激活有关.HO-1可作为外源基因导入体内治疗肺动脉高压.     

一种简单易行的细胞凋亡检测方法

目的 以青蒿素诱导人胶质瘤U251细胞凋亡为例,介绍一种简单易行的细胞凋亡检测方法.方法 将用青蒿素处理过的、悬浮培养的人胶质瘤U251细胞,用液氮冻融,然后加入3mmol/L的PI 30μL,室温下放置5min后,用流式细胞仪测定细胞的倍体特性,计算细胞凋亡率.结果 在1×10-4、1×10-5和1×10-6mol/L剂量下,青蒿素诱导人胶质瘤U251细胞的凋亡率分别为33.2%、24.0%和8.0%.结论 本实验结果显示,青蒿素有明显的诱导人胶质瘤U251细胞凋亡的作用,并显示有明显的剂量依赖关系.本方法简化了细胞处理过程,避免了许多影响因素,不失为一种简单、准确、快速的细胞凋亡检测方法.