顺铂作用于人肝癌细胞系HepG2后肿瘤干细胞标志物增加

目的探讨顺铂(cisplatin)作用于人肝癌细胞系HepG2后细胞增殖能力和周期的变化,及残余细胞中CD133、ABCG2及ICAM-1表达量的变化。方法以人肝癌细胞系HepG2为研究对象,分别采用MTT比色法和PI染色法检测不同浓度cisplatin作用后细胞增殖能力及细胞周期分布的变化;免疫荧光法检测cisplatin对肿瘤干细胞标志物表达量的影响。结果不同浓度cisplatin作用后均可明显抑制HepG2细胞的增殖。进一步研究发现,分别使用4mg/L和2mg/L的cisplatin作用48h后对HepG2细胞周期G0/G1期及S期有显著影响,cisplatin处理使残留HepG2细胞中CD133、ABCG2及ICAM-1的表达量明显升高。结论 HepG2细胞中存在的小部分肝癌干细胞能够逃脱cisplatin的杀伤作用,此种逃避过程的发生可能是临床上肝癌经治疗后复发的重要原因。     

ADSCs与HUVECs体外共培养促进HUVECs增殖及成血管化作用

目的为制备血管化胰岛,分离、培养脂肪来源干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs),观察细胞共培养条件下,ADSCs对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVECs)增殖及成血管化功能的促进作用并探讨其机制。方法采用胶原酶消化法分别原代培养获得ADSCs与HUVECs,细胞形态学、免疫荧光或多向诱导分化鉴定,建立HUVECs与ADSCs接触式及间接共培养体系,设立HUVECs单独培养为对照组,比较两组成血管化功能、HUVECs增殖状况及上清液血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,b-FGF)浓度。结果通过原代培养成功获得ADSCs与HUVECs;第3代ADSCs呈均一的长梭形纤维细胞样形态,免疫荧光检测见CD44/CD49d(+)、CD31/CD34(-),并具有多向分化功能;第2代HUVECs免疫荧光检测示vWF/CD31(+)。于Matrigel内接触式共培养4h,ADSCs+HUVECs组血管密度高于HUVECs组;间接共培养时,HUVECs生长曲线于ADSCs+HUVECs组上移,在对数生长期的第3、4、5天,ADSCs+HUVECs组HUVECs计数为(4.52±0.31)×104、(7.18±0.45)×104、(8.23±0.36)×104,大于单独HUVECs组的(2.71±0.25)×104、(4.87±0.26)×104、(6.86±0.33)×104(P<0.01);ADSCs+HUVECs组HUVECs群体倍增时间为(1.36±0.23)d,短于单独HUVECs组的(1.62±0.31)d。四甲基噻唑蓝(methylthiazol tetraztlium,MTT)法测定HUVECs的A值培养第1、3、5、7天的ADSCs+HUVECs组高于单独HUVECs组(P<0.01)。培养第3、7、13天时ADSCs+HUVECs组上清液VEGF、b-FGF浓度均高于HUVECs组(P<0.01)。结论 ADSCs与HUVECs共培养时,ADSCs可能通过分泌或增加HUVECs分泌VEGF、b-FGF等细胞因子,进而促进HUVECs增殖及成血管化。     

恒磁场对人脐动脉血管平滑肌细胞胞浆游离钙离子浓度的影响

目的 研究恒磁场对培养的人脐动脉血管平滑肌细胞(VSMC)胞浆内游离钙离子浓度([Ca2 ]i)的影响,探讨恒磁场抑制VSMC增殖的作用机制.方法 离体培养人脐动脉VSMC,不同强度的恒磁场垂直作用于VSMC,应用激光共聚焦显微镜观察恒磁场对VSMC胞浆[Ca2 ]i的影响.结果 5 mT的恒磁场作用于VSMC后10-50 min[Ca2 ]i较对照组明显下降,20 min下降最明显;其平滑肌细胞的Ca2 荧光强度明显弱于对照组,至60 min接近对照组.结论 恒磁场对VSMC胞浆[Ca2 ]i有明显降低作用,可能是抑制VSMC细胞增殖的机制.为经皮冠状动脉成型术(PTCA)术后再狭窄的治疗提供了新的理论基础.     

丹参酮ⅡA对人肝癌细胞Ang-2及其受体Tie-2表达的影响

目的观察丹参酮ⅡA对人肝癌SMMC-7721细胞株Ang-2及其受体Tie-2表达的影响,探讨其抗癌的作用机制。方法体外培养肝癌SMMC-7721细胞株,经不同浓度丹参酮ⅡA作用后,MTT方法测定细胞增殖,免疫细胞化学法测定Ang-2及其受体Tie-2表达,ELISA法检测细胞培养液中Ang-2和VEGF水平。结果丹参酮ⅡA对肝癌细胞的生长有明显抑制作用,并呈剂量依赖性。免疫细胞化学检测显示,随着丹参酮ⅡA作用浓度的增大,Ang-2及其受体Tie-2表达下调,其在1.0μg/mL组作用48h的高表达率分别为33.33%、40.00%,灰度值分别为167.43±12.44和169.05±15.59,与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);ELISA法检测显示,丹参酮ⅡA作用组细胞培养上清液中Ang-2和VEGF含量明显下降。结论抑制Ang-2及其受体Tie-2表达可能是丹参酮ⅡA抗肝癌作用的机制之一。     

大鼠主动脉血管平滑肌舒张因子的释放

目的 通过观察内皮舒张因子（ＥＤＲＦ）对去甲肾上腺素（ＮＥ）和去氧肾上腺素（ＰＥ）经起的缩血管效应的影响，研究大鼠主动脉平滑肌释放平滑肌舒张因子（ＭＤＲＦ）的可能性。方法 内皮完整和去内皮大鼠主动脉环悬于器官浴槽中，测定血管的张力和收缩速度的变化。实验在消炎痛和普萘洛尔存在下进行。结果 用甲烯蓝和左旋硝基精氨酸处理内皮完整的大鼠主动脉环，ＮＥ和ＰＥ的剂量－反应曲线明显左移。ＥＣ３０值降低７倍和５倍     

环氧合酶-2和ki-67在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达

目的研究环氧合酶-2(COX-2)和ki-67在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样变(CIN)、宫颈鳞状细胞癌(SCC)中的表达及其相关性。方法RT-PCR法检测COX-2 mRNA在正常、炎性、CIN组织和SCC组织中的表达;免疫组化法检测各组中COX-2和ki-67蛋白的表达。结果COX-2 mRNA和蛋白在正常组无表达,在炎性、CIN和SCC组表达升高(P<0.05),COX-2蛋白的表达与肿瘤体积和浸润深度有关(P<0.05)。ki-67在正常组中偶有表达,在炎性组和CIN组表达增高,在SCC组显著增高(P<0.01)。COX-2与ki-67蛋白的表达相关(r=0.675,P<0.001)。结论COX-2表达增高可能是宫颈癌发生发展的早期事件,与细胞异常增生有关。     

大鼠PER2基因RNAi慢病毒载体的构建及干扰效率的测定

目的构建及筛选有效干扰大鼠血管平滑肌细胞PER2基因的shRNA慢病毒载体,并测定其干扰效率。方法设计大鼠PER2的siRNA靶序列,插入慢病毒载体质粒pGLV-U6-EGFP中,构建pLentivirus-per2-rat表达重组体并转染至A7r5大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞内,利用Real-time PCR方法检测PER2基因的mRNA表达水平,筛选有效沉默钟基因PER2表达的RNAi慢病毒载体。结果经电泳、基因测序证实插入的目的序列正确,有PER2表达,成功构建了pLentivirus-per2-rat表达重组体;转染慢病毒载体pLentivirus-per2-rat至A7r5大鼠胸血管平滑肌细胞,测定转染效率达70%;Real-time PCR检测PER2基因的mRNA相对表达量,筛选出有效干扰大鼠血管平滑肌细胞钟基因Per2表达的siRNA片段,使PER2mRNA表达量下调约84%。结论成功构建了大鼠PER2的RNAi慢病毒载体,为进一步研究时钟基因的功能奠定了基础。     

乙型肝炎病毒全X基因对HEK293细胞功能的影响

目的克隆并构建乙型肝炎病毒(HBV)全X基因表达载体,探讨HBV全X基因对HEK293细胞功能的影响,并比较HBV全X基因与X基因对细胞影响的差异。方法应用基因克隆的方法从慢性HBV感染者血清中获得HBV全X及X基因,构建带有HBV全X基因与X基因的真核表达载体以及带有绿色荧光基团GFP的重组质粒;细胞转染技术将其分别转入HEK293细胞,RT-PCR及Western-blot技术验证HBV全X基因及X基因在细胞内的表达;荧光显微镜下观察其在细胞内的定位情况;MTT法检测细胞增殖率的变化;Annexin V流式细胞分析技术检测其对细胞凋亡率的影响;TRAP实时荧光定量PCR法检测各组细胞端粒酶活性的变化。结果成功构建带有HBV全X基因的重组质粒且目的基因能在HEK293细胞内高表达;表达的HBV全X蛋白主要分布在胞核,而X蛋白在胞质、胞核均有分布;转染HBV全X和X基因后细胞增殖率分别为(0.826±0.002)%和(0.805±0.013)%,显著高于转染空质粒(0.691±0.035)%和未转染对照组(0.681±0.018)%,差异具有统计学意义(P<0.05);转染HBV全X和X基因后细胞凋亡率分别为(25.25±3.02)%及(21.34±2.16)%,显著高于转染空质粒(13.49±1.49)%及未转染细胞对照组(11.37±1.58)%,差异具有统计学意义(P<0.05);转染全X及X基因细胞的端粒酶活性亦显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);全X转染组细胞的增殖率、凋亡率及端粒酶活性均高于X转染组,但差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 HBV全X基因具有促细胞增殖、凋亡以及影响细胞端粒酶活性的作用,其可能通过不同于HBV X基因的细胞内途径影响细胞的生物学功能,从而在HBV相关的原发性肝细胞癌发生发展中起作用。     

PPAR-γ激活对血管平滑肌细胞外基质释放及结缔组织生长因子表达的影响

目的观察PPAR-γ激活对血管紧张素Ⅱ诱导的体外培养条件下大鼠血管平滑肌(VSMCs)的细胞外基质(ECM)释放及结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响。方法原代培养大鼠VSMCs,用不同浓度PPAR-γ激动剂rosiglitzone和/或抑制剂GW9662、BADGE预处理后,加入0.1μmol/L血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激24h。比色法检测各组细胞培养液中羟脯氨酸含量,实时荧光定量RT-PCR方法检测各组三型胶原(ColⅢ)、层粘连蛋白(FN)及CTGFmRNA表达,Western blotting检测各组CTGF、PPAR-γ蛋白表达情况,基于ELISA的DNA-binding检测各组PPAR-γ活性。结果 AngⅡ可增加VSMCs PPAR-γ表达,但明显抑制其活性(P<0.05,vs.Control),PPAR-γ激动剂rosiglitazone可显著增加PPAR-γ蛋白表达及活化(P<0.05,vs.AngⅡ)。rosiglitazone可降低细胞培养液中羟脯氨酸含量,下调VSMCs中ColⅢ、FN、CTGF mRNA表达,抑制CTGF蛋白表达,而其他PPAR-γ激动剂(pioglitazone、15-d-PGJ2)均有相似作用,PPAR-γ拮抗剂GW9662及BADGE可拮抗这一作用。结论在VSMCs中,PPAR-γ激活可抑制AngⅡ诱导的CTGF表达,同时抑制ECM沉积。提示PPAR-γ可能在血管纤维化中起重要作用。     

蟾蜍灵对顺铂耐药胃癌SGC7901细胞增殖与凋亡的影响及其作用机制

目的探讨蟾蜍灵(bufalin)对顺铂耐药胃癌细胞(SGC7901/CDDP)增殖及凋亡的影响及其作用机制。方法采用MTT比色法检测bufalin对SGC7901/CDDP细胞增殖的抑制作用;应用流式细胞术PI染色检测细胞凋亡;应用Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。结果 Bufalin以时间和剂量依赖方式抑制SGC7901/CDDP细胞增殖,24、48、72h的IC50值分别为106.3、53.8、10.9nmol/L。选取10、50、100nmol/L的bufalin作用SGC7901/CD-DP细胞24h,凋亡率分别为7.3%、12.6%和26.4%,呈浓度依赖性。Western blot分析结果表明,SGC7901/CDDP细胞经10、50、100nmol/L的bufalin处理后,促凋亡基因Bax表达逐渐上调,抗凋亡基因Bcl-2表达逐渐减弱。结论 Bufalin在体外能够抑制对顺铂耐药的胃癌细胞(SGC7901/CDDP)的增殖,且通过调控Bcl-2、Bax的表达而诱导细胞凋亡。