白花蛇舌草总黄酮对TGF-β1诱导的肝癌MHCC97-H细胞EMT的逆转作用及其机制

目的探讨白花蛇舌草总黄酮(FOD)对TGF-β1诱导肝癌细胞MHCC97-H上皮细胞间质转化(EMT)的逆转作用及其相关机制。方法用TGF-β1诱导MHCC97-H细胞建立EMT模型,再将其分为5组:正常对照组、TGF-β1组、TGF-β1+FOD组、TGF-β1+5-FU组及TGF-β1+FOD+5-FU组,分别干预48h,Transwell侵袭小室法检测细胞体外侵袭能力,Western blot法检测各组细胞中E-cadherin、vimentin蛋白的表达。结果与正常细胞形态相比,TGF-β1诱导后细胞呈现明显的长梭形,且侵袭能力增强(P=0.02);给予药物处理后,TGF-β1+FOD组、TGF-β1+5-FU组细胞的穿透能力较TGF-β1组减弱(P=0.03、P=0.02),且联合用药组减弱程度更加明显(P=0.01);Western blot结果显示,TGF-β1组细胞中E-cadherin蛋白表达显著降低(P=0.01),vimentin蛋白的表达显著增加(P=0.01),TGF-β1+FOD组、TGF-β1+5-FU组E-cadherin蛋白表达有所上调(P=0.03、P=0.02),vimentin蛋白的表达有所下调(P=0.04、P=0.03),且联合组变化更为显著(P=0.01)。结论 FOD能够逆转TGF-β1诱导的肝癌MHCC97-H细胞的上皮间质转化,其机制可能与其抑制TGF-β1诱导的E-cadherin蛋白下调及上皮细胞间质转化相关。     

KLF5转录因子抑制TRAIL诱导PC-3前列腺癌细胞凋亡的分子机制

目的探究通过抑制KLF5表达促进TRAIL诱导的前列腺癌PC-3细胞凋亡的分子机制。方法在TRAIL诱导下,使用MTT实验、流式细胞实验、Western blot及qRT-PCR检测KLF5敲低组与对照组的PC-3细胞在细胞活性、凋亡比例及凋亡相关标志物的表达。结果在PC-3细胞中抑制KLF5表达后,TRAIL诱导下的细胞凋亡明显增加,TRAIL受体DR4、DR5表达上升,凋亡抑制因子c-FLIP蛋白表达下调,但是其mRNA表达水平不变。结论抑制KLF5,可以通过上调TRAIL受体、下调c-FLIP蛋白表达的途径,促进TRAIL诱导的前列腺癌PC-3细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞增殖。使用小干扰RNA或小分子药物抑制KLF5表达,可能是潜在的激素非敏感前列腺癌治疗手段。     

米诺环素治疗外周神经损伤所致神经病理性痛的时间窗

目的探讨米诺环素治疗外周神经损伤所致的神经病理性痛的作用机制及其时间窗。方法通过行为药理学方法证实鞘内注射米诺环素对大鼠脊神经结扎(spinal nerve ligation,SNL)所导致的神经病理性痛的镇痛作用以及其作用时间窗,并通过免疫荧光化学方法观察脊髓背角小胶质细胞的活化变化。结果脊神经结扎后盐水对照组动物出现明显的神经病理性痛,同时形态学结果显示脊髓背角小胶质细胞明显活化;脊神经结扎术后1、3、7d鞘内注射米诺环素,与盐水组对比可有效减轻神经病理性痛,同时可以抑制脊髓背角小胶质细胞的活化;脊神经结扎后10、21d鞘内注射米诺环素,与盐水组比较虽能够抑制小胶质细胞的活化,但却不能缓解神经病理性痛。假手术组无论是鞘内给予米诺环素还是生理盐水都不影响动物的痛行为学变化以及脊髓背角的形态学变化。结论鞘内注射米诺环素可以通过抑制脊髓背角小胶质细胞活化治疗外周神经损伤所致的神经病理性痛,其治疗时间窗为神经病理性痛发生的早期。     

HtrA1表达被沉默的滋养细胞株HPT-8/pSilencer4.1-HtrA1的构建

目的构建pSilencer4.1/HtrA1质粒,稳定转染人滋养细胞株HPT-8。方法免疫组化SABC方法检测HtrA1在HPT-8细胞中的表达;构建pSilencer4.1/HtrA1质粒;将pSilencer4.1/HtrA1质粒、pSilencer4.1空白质粒转染HPT-8,观察转染后细胞HtrA1的表达情况。结果 HPT-8约90%左右的细胞胞质被染成棕黄色,胞核未见明显染色。转染pSilencer4.1/HtrA1质粒的HPT-8细胞的G418筛选质量浓度为200μg/mL。RT-PCR、Western blot法鉴定转染细胞HtrA1的表达,结果显示转染Psilence4.1/HtrA1重组质粒的细胞中HtrA1表达水平较空白质粒、正常细胞明显下降(P均<0.05)。空白质粒组、HPT-8组间吸光度值无统计学差异(P>0.05)。结论成功构建了稳定的、HtrA1沉默表达的滋养细胞株HPT-8/pSilencer4.1-HtrA1,为下一步的研究奠定了实验基础。     

α-硫辛酸对小鼠卵巢颗粒细胞氧化应激损伤和凋亡的影响

目的探讨α-硫辛酸对小鼠颗粒细胞培养过程中抗氧化水平和抗凋亡水平的影响。方法收集经PMSG处理的小鼠卵巢颗粒细胞,经原代培养24h后,添加终浓度为100μmol/L的α-硫辛酸继续培养24h,测定氧化水平SOD、MDA和GSH-Px参数,评价抗氧化能力,采用Trizol法提取各组细胞的RNA,进行RT-PCR法检测α-硫辛酸对caspase-3和caspase-9基因的表达情况的影响,同时利用细胞免疫荧光和ELISA法检测caspase-3和caspase-9蛋白表达,并分析α-硫辛酸降低细胞凋亡的作用。结果分离培养的小鼠卵巢颗粒细胞α-硫辛酸添加后,SOD和GSH-Px活性升高,MDA含量降低(P<0.05);经过RT-PCR扩增技术获得长度为180bp的特异性caspase-3产物,获得长度为152bp的特异性caspase-9产物,α-硫辛酸添加可显著性降低caspase-3和caspase-9mRNA的表达(P<0.05);免疫荧光细胞化学染色显示颗粒细胞caspase-3和caspase-9蛋白阳性染色定位于细胞胞质,分别呈现绿色荧光和红色荧光,细胞核呈蓝色荧光;ELISA结果显示α-硫辛酸添加后caspase-3和caspase-9酶活性显著下调(P<0.05)。结论小鼠颗粒细胞培养过程中添加α-硫辛酸可明显改变细胞抗氧化能力,对卵巢颗粒细胞培养过程中的氧化应激诱导的细胞凋亡起到一定的保护作用。     

miR146通过靶向Notch 1促进骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化

目的探讨miR146在骨髓间充质干细胞(BMSC)向髓核样细胞分化中的作用及其机制。方法从SD大鼠中分离培养BMSC,传至第3代用于本实验。以TGFβ1(转化生长因子-β1)诱导BMSC向髓核样细胞分化为模型。检测TGFβ1诱导BMSC后蛋白多糖(ACAN)、Ⅱ型胶原蛋白(COLⅡ)和SOX 9的蛋白及mRNA表达水平;RT-PCR检测miR146的表达水平。随后通过上调或下调miR146水平,检测ACAN、COLⅡ和SOX 9的蛋白及mRNA表达水平;双荧光素酶报告系统验证miR146的靶基因,并上调或下调miR146水平后检测靶基因的蛋白表达水平;过表达靶基因并检测其与miR146 mimic共转染对ACAN、COLⅡ和SOX 9表达的影响。最后,上调或下调靶基因后,检测miR146表达水平的变化。结果 TGFβ1诱导BMSC向髓核样细胞分化后ACAN、COLⅡ、SOX 9和miR146高表达。上调miR146后,ACAN、COLⅡ和SOX 9的表达升高;下调miR146后ACAN、COLⅡ和SOX 9的表达降低。双荧光素酶报告系统证实,Notch1是miR146的靶基因,miR146通过抑制Notch1的表达上调ACAN、COLⅡ和SOX 9的表达水平。上调Notch1后miR146表达下调,下调Notch1后miR146表达上调。结论 miR146通过靶向Notch1促进骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化,Notch1对miR146亦具有负向调控作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞对RH-35肝癌细胞侵袭能力的影响

目的观察大鼠骨髓来源间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对RH-35肝癌细胞侵袭能力的影响。方法密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓MSCs,成骨与成脂诱导分化鉴定其分化能力。收集MSCs条件培养基(MSCs-CM),与RH-35细胞共培养72h,Transwell小室观察MSCs-CM对RH-35细胞侵袭转移能力的影响;Realtime PCR与Western blot法检测Snail与基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达。结果分离的MSCs形态均一,具有良好的成骨与成脂分化能力。在MSCs-CM(500mL/L)作用下,RH-35的侵袭能力明显增强;Real-time PCR与Western blot均显示,MSCs-CM处理组中RH-35细胞Snail和MMP-9的表达较对照组显著升高(P<0.05)。结论MSCs在体外能够增强肝癌细胞系RH-35的侵袭转移能力,其促肝癌细胞体外侵袭可能与Snail与MMP-9表达上调有关。     

pEGFP-N1-TNFα表达载体的构建与鉴定

目的构建pEGFP-N1-TNFα重组质粒并鉴定,为转导CIK细胞并定位表达奠定基础。方法以pMD19Sim-ple T-TNFα为模板,PCR扩增TNFαCDS区片段,将PCR产物进行15g/L琼脂糖凝胶电泳,并回收TNFα条带,用BglⅡ和HindⅢ将TNFα的PCR片段及目的载体pEGFP-N1双酶切,然后进行连接。连接产物转化至DH5α中。挑取克隆,提质粒,进行鉴定。结果 PCR扩增片段、双酶切出现722bp大小的目的基因条带与预期结果相符;插入片断测序结果与合成的寡核苷酸序列一致。结论成功构建了重组质粒pEGFP-N1-TNFα,为下一步用纳米材料转染CIK细胞的研究奠定了基础。     

低硒大鼠心肌线粒体CytC含量的动态变化及其在心肌细胞凋亡中的作用

目的检测低硒大鼠心肌线粒体中细胞色素C(CytC)的蛋白含量及心肌细胞凋亡情况,探讨低硒时CytC在线粒体介导的细胞凋亡中的作用机制。方法构建低硒大鼠模型,于喂养20、30、40周时提取心肌线粒体,Western Blot法检测线粒体中CytC的蛋白表达;免疫组织化学技术(SP法)对死亡结构域蛋白FADD进行原位染色,统计阳性细胞指数,并对CytC与心肌细胞凋亡指数进行相关性分析。结果低硒组CytC的表达与相应时段的对照组相比均降低,且随低硒喂养时间延长,降低更为明显,差异均有统计学意义(P<0.05);各时间对照组间心肌线粒体中CytC的表达无明显差异;免疫组化染色显示,随着喂养时间的延长,低硒组大鼠心肌细胞凋亡加重;相关性分析显示,线粒体内CytC表达与心肌细胞凋亡指数呈负相关(rs=-0.858,P<0.01)。结论低硒可影响大鼠心肌线粒体中CytC蛋白的表达;CytC表达与心肌细胞凋亡指数具有相关性,提示CytC在线粒体介导的心肌细胞凋亡中起重要作用。     

干扰素α_(2b)抑制大鼠肝纤维化形成的实验研究

以 40 %四氯化碳花生油诱导大鼠肝纤维化模型 ,同时用重组干扰素 α2 b( IFN-α2 b)及秋水仙碱 ( COL )做预防性治疗 ,观察 IFN-α2 b对大鼠肝纤维化形成的影响。结果发现 IFN- α2 b及 COL治疗组血清 AL T、AST、 型前胶原、 型胶原及透明质酸水平 ,以及肝组织纤维化程度均显著低于模型组 ,IFN- α2 b组肝组织炎症活动度及 、 型胶原 ,TNF- α显色指数均显著小于模型组。作者认为 ,IFN- α2 b可通过保护肝细胞、减轻肝组织炎症坏死、抑制 TNF- α对贮脂细胞的激活等机制 ,而抑制大鼠肝纤维化的形成