重组人细胞角蛋白9 cDNA的原核表达及纯化

目的克隆人细胞角蛋白CK9的cDNA,通过原核表达系统表达融合蛋白并进行纯化和鉴定。方法从人角质形成细胞系(HaCaT)中提取RNA,以RT-PCR反转录cDNA,使用特异性引物PCR扩增出人CK9编码区全长并克隆到pET-28a载体上,再用IPTG诱导融合蛋白his-CK9的表达。表达的融合蛋白通过Ni 2+亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果测序鉴定构建表达载体中CK9的cDNA序列正确;融合蛋白his-CK9可在大肠杆菌中诱导表达;纯化的融合蛋白his-CK9纯度较高;纯化的融合蛋白his-CK9可与商品化CK9抗体特异性结合。结论成功构建原核表达载体pET-28a-CK9,并成功诱导及纯化融合蛋白his-CK9。     

HBxAg对胎盘滋养细胞凋亡的影响及其作用机制

目的探讨乙型肝炎病毒X(HBx)蛋白对胎盘滋养层细胞凋亡水平的影响及可能的作用机制。方法将已构建好的HBx基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBx瞬时转染人绒毛膜癌细胞株JEG-3及HTR-8,分别以转染空载体pcDNA3.1(+)和未转染作为阴性对照组和空白对照组,转染后48h,以逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)鉴定HBx-mRNA,间接免疫荧光法和蛋白印迹法(Western blot)鉴定HBxAg的表达;流式细胞仪AnnexinⅤ+PI双染方法检测细胞凋亡状态;间接免疫荧光法、流式细胞仪及Western blot检测PI3K、pAKT的表达。结果JEG-3及HTR-8转染组中均有HBx蛋白表达,而在对照组未被检测到;转染组JEG-3、HTR-8细胞早期凋亡率小于阴性对照组(P<0.05),PI3K和pAKT1的表达水平高于阴性对照组(P<0.05),然而AKT1蛋白表达水平在转染组、阴性对照组和空白对照组间无显著性差别。结论 HBx基因可以成功地转入JEG-3及HTR-8细胞,HBx转染后可抑制滋养细胞凋亡,这可能与HBx激活PI3K/pAKT信号通路有关。     

大鼠弥漫性轴索损伤后海马CA1区锥体神经元电活动变化

目的观察弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury,DAI)后大鼠海马CA1区锥体细胞自发放电的特征,揭示DAI对大鼠海马CAl区锥体神经元兴奋性的影响。方法雄性健康成年SD大鼠30只,随机分为正常对照组及DAI后6h组、12h组、24h组、72h组。采用玻璃微电极细胞外记录的方法记录海马神经元的放电活动,每只动物记录2个单位放电。分析比较各组各个单位放电的放电类型、放电频率等差异。结果 1DAI后各组与正常组大鼠海马CA1区锥体细胞观察到3种类型放电,即不规则放电、规则放电和簇式放电。在放电类型上各组差异无统计学意义。2比较各组的12个单位放电的平均放电频率、平均ISI可得出DAI后12h组的平均放电频率低于其他组,差异有统计学意义;其他组比较差异则无统计学意义。3比较各组簇式放电的簇内ISI:DAI后12h组最小,其次是24h组、72h组,6h组与正常组最大且差异无统计学意义。结论 DAI对大鼠海马CAl区锥体神经元兴奋性具有明显影响,并且呈不同放电类型的动态变化。     

CHOP在间歇低氧大鼠认知功能减退中的表达及意义

目的探讨C/EBP同源蛋白(CHOP)在间歇性低氧大鼠认知功能减退中的表达变化及其意义。方法将75只雄性Wistar大鼠随机分为正常组(NC组)、5%间歇低氧组(5%CIH组)、10%间歇低氧组(10%CIH组),每组25只;每组又各分为3、7、14、21、28d时间亚组,每个时间亚组5只。正常组暴露于空气中,间歇低氧组分别暴露于间歇性低氧条件下(暴露时间每天8h,持续时间3、7、14、21、28d)。采用Morris水迷宫检测大鼠学习记忆功能,免疫组化检测海马CA1区CHOP表达,TUNEL法检测海马CA1区神经细胞凋亡。结果 1与NC组比较,2个CIH组动物逃避潜伏期随低氧时间的延长而延长(P<0.05),跨越目标象限的时间随低氧时间的延长而缩短(P<0.05),海马神经元凋亡指数随缺氧时间的延长均逐渐升高(P<0.05);与10%CIH组比较,5%CIH组上述变化有统计学意义(P<0.05)。2与NC组比较,2个CIH组CHOP蛋白的表达随缺氧时间的延长于各个时间点均增加(P<0.05),其中10%CIH组于28d达峰,5%CIH组于21d达峰后下降。3双变量相关分析显示,2个CIH组其CHOP表达与凋亡指数、动物逃避潜伏期时间均呈正相关,与跨越目标象限时间均呈负相关。结论间歇性低氧可以引起不同程度的认知功能减退,可能与其诱导CHOP高表达并激活CHOP介导的神经细胞凋亡密切相关。     

miRNA-141、miRNA-145在非小细胞肺癌中的表达及与临床病理的关系

目的通过检测miRNA-141、miRNA-145在非小细胞肺癌中的表达,探讨其与非小细胞肺癌临床病理的关系。方法采用Real time-PCR法对48例非小细胞肺癌组织及正常肺组织的miRNA-141、miRNA-145进行定量分析,结果由2(-△△CT)处理,并分析与临床病理资料的关系。结果 1NSCLC患者肿瘤组织中miRNA-141表达水平明显升高,而且其表达与临床分期、病理类型显著相关(P<0.05),miRNA-141在鳞癌患者肿瘤组织表达高于腺癌(P<0.05),而在不同年龄、性别、肿瘤大小患者间差异无统计学意义(P>0.05)。2NSCLC患者肿瘤组织中miRNA-145表达水平明显下降,而且其表达与临床分期、病理类型显著相关(P<0.05),miRNA-145在腺癌患者肿瘤组织表达低于鳞癌(P<0.05),而在不同年龄、性别、肿瘤大小患者间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 miRNA-141高表达及miRNA-145低表达与非小细胞肺癌的临床分期、病理分级密切相关,miRNA-141、miRNA145有可能作为非小细胞肺癌的重要肿瘤标志物。     

Survivin反义核酸联合紫杉醇对皮下荷瘤Balb/c小鼠模型的治疗作用

目的研究survivin反义核酸与紫杉醇联合应用对皮下荷瘤Bal b/c小鼠模型的治疗作用,并初步探讨对其抗癌作用的机制。方法在Bal b/c小鼠皮下注射C26细胞,建立皮下瘤模型,采用瘤内注射的方式,将实验分空白组(C)、lipo2000对照组(L)、紫杉醇组(T)、survivin反义核酸组(A)、survivin反义核酸联合紫杉醇组(A+T)5个不同组,观察肿瘤的生长状态,TUNEL法检测凋亡细胞,Western blot法检测survivin蛋白表达。结果 1各治疗组均达到了(T/C)<60%,与L组比较差异有统计学意义(P<0.05),体内证实给药干预有效;小鼠瘤重的抑瘤率结果显示,与C组比较,T、A、A+T各给药组均能抑制小鼠瘤重,差异具有统计学意义(P<0.05),从抑制肿瘤质量增长方面而言,二者联合用药[瘤重抑瘤率为(54.16±0.32)%]将紫杉醇[瘤重抑瘤率为(21.82±0.84)%]的抗癌活性提高了59%以上;2TUNEL法检测凋亡细胞:空白对照组几乎没有肿瘤细胞凋亡。T组及A组有一定量的凋亡细胞,以上试验结果提示,紫杉醇具有促进肿瘤细胞凋亡的能力,A+T不仅加强了对肿瘤细胞的杀伤作用,而且二者的协同作用可能对肿瘤耐药性有所影响,最终使得其促肿瘤细胞凋亡的作用尤为显著;3survivin蛋白表达:结果显示,A+T组survivin蛋白的表达明显降低,而不影响β-actin的表达,C组和L组相比无明显变化,T组、A组、A+T组A值的比值分别为0.895±0.011、0.704±0.121、0.345±0.019,经方差分析,A+T组与C、L、A、T组的表达量差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 survivin反义核酸与紫杉醇联合用药,可能通过下调survivin蛋白的表达从而促进肿瘤细胞凋亡,联合用药可降低机体耐药性,发挥协同作用。     

针灸对IL2-IFN-NKC调节网与其相关网络MΦ-IL1-Th的效应——针灸并施对荷瘤(S_(37))小鼠相关网络的效应

目的　以荷瘤 (S37)小鼠为模型 ,进一步验证针灸并施的抗肿瘤和对IL2 IFN NKC调节网的相关网络MΦ IL1 Th的效应。方法　针灸荷瘤 (S37)小鼠的大椎、后海二穴后 ,取样 ,以吞噬中性红比色分析法 ,MTT比色分析法和单抗SPA Ig花环法等观察针灸对MΦ、IL1、Th及S37肉瘤的影响。结果　荷瘤针灸并施组、荷瘤艾灸组、荷瘤针刺组的小鼠腹腔MΦ吞噬功能、IL1含量及Th细胞 (L3T4)百分率均较荷瘤对照组显著增高 ;除针刺组外 ,其余两实验组均对S37肉瘤有明显抑制作用。另外 ,针灸组和艾灸组IL1含量均较针刺组显著增高 ;针灸组Th细胞(L3T4)较针刺组显著增高。结论　针灸荷瘤小鼠大椎、后海二穴 ,具有正向调节IL2 IFN NKC网的相关网络MΦ IL1 Th和抑瘤 (S37)作用。艾灸也显示出相似的效果。     

外源性硫化氢对大鼠肠缺血再灌注损伤后肠黏膜细胞凋亡的影响

目的研究外源性硫化氢(H2S)对肠缺血再灌注损伤(I/RI)后肠黏膜细胞凋亡的影响,为临床治疗肠I/RI的新药开发提供依据。方法以硫氢化钠(Na HS)作为硫化氢的外源性供体,将32只健康雄性Wistar大鼠分为四组:(A)正常对照组、(B)假手术组、(C)肠IR/I模型组、(D)肠IR/I+H2S(Na HS,14umol/kg)干预组,每组8只。通过HE染色观察小肠组织的形态学改变,并用流式细胞术检测肠黏膜细胞的凋亡率。结果肠IR/I+H2S组比肠IR/I组的肠黏膜损伤明显减轻,肠黏膜细胞的凋亡率也明显降低。结论在肠I/RI中,H2S能降低肠黏膜细胞的凋亡,起到保护肠黏膜的作用。     

SH—SY5Y细胞基因片段文库及数据库的建立

目的：建立SH-SY5Y细胞基因片段文库和一种对大量cDNA片段数据管理系统的方法。方法：采用RD-PCR技术构建SH-SY5Y细胞基因片段文库，并对每一个克隆进行测序。应用FOXPRO编制一个软件对其大量的信息进行系统化管理。结果：应用RD-PCR技术建立了细胞的cDNA片段文库，由1200余个片段克隆组成；应用FOXPRO制作了基因片段数据信息管理系统的软件，对此文库片段的测序数据进行管理。结论：采用RD-PCR技术是一个很好的建立基因片段文库的方法；建立了基因片段数据信息管理系统的软件进行这个文库数据的管理。