miR-126修饰的间质干细胞来源的外泌体对大鼠早期缺血性股骨头坏死的影响

目的观察微小RNA-126(miR-126)修饰的间质干细胞来源的外泌体(MSC-126-Exos)对类固醇激素诱导的早期缺血性股骨头坏死(SANFH)的治疗作用,并探讨其潜在机制。方法分别以80 mg/L MSC-126-Exos和MSCExos处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs)并设PBS处理组为对照,MTT、划痕实验以及成管实验分别观察各组细胞增殖、迁移和毛细血管网的形成,Western blot检测HUVECs中血管内皮生长因子A(VEGFA)的表达。构建大鼠SANFH模型,分别注射等量MSC-126-Exos、MSC-Exos和PBS,6周后,通过对股骨头区域组织进行CD31免疫荧光染色及其Micro-CT扫描,观察股骨头血管数量及骨质情况。结果体外实验中,MSC-126-Exos组的HUVECs的增殖、迁移和成管较MSC-Exos组显著增强,且VEGFA的表达水平也上调,差异有统计学意义(P<0.05)。在体实验中,MSC-126-Exos组大鼠股骨头坏死区CD31免疫荧光标记的血管数量较MSC-Exos组和模型组显著增多(P<0.05),且股骨头坏死区Micro-CT扫描显示MSC-126-Exos组的小梁厚度(Tb.Th)、小梁数(Tb.N)和每组织体积骨量(BV/TV)值也显著高于MSC-Exos组和模型组,而小梁分离度(Tb.Sp)显著降低(P<0.05)。结论 MSC-126-Exos可以促进内皮细胞功能,改善股骨头区的血运从而增强骨质沉积,对大鼠SANFH具有显著的治疗效果。     

脂肪旁分泌介导肥胖对食管鳞癌细胞生物学行为的影响

目的明确肥胖与食管鳞癌之间的关系并阐述其相关分子机制。方法通过内脏脂肪组织体外培养获得条件培养基从而模拟脂肪旁分泌过程,进而培养食管鳞癌细胞,通过MTT、流式细胞仪、RT-PCR、Western blot等途径分析内脏脂肪旁分泌介导肥胖对食管鳞癌细胞增殖、凋亡、细胞周期及相关基因表达等的影响。结果与非肥胖组相比,肥胖组Eca109细胞增殖明显增加(P<0.05);细胞凋亡率明显减少[(18.63±3.69)%vs.(29.97±2.00)%,P<0.05];细胞周期中S期增加(P<0.05)、G0/G1期减少(P<0.05);AMPK、磷酸化YAP蛋白表达下降(P<0.05),总YAP蛋白表达升高(P<0.05);AMPK mRNA表达下降(P<0.05),YAP mRNA表达升高(P<0.05)。结论肥胖通过内脏脂肪旁分泌方式改变食管鳞癌细胞生物学行为并调控与糖脂代谢、肿瘤生长密切相关的AMPK-YAP信号通路。     

补骨脂素对乳腺癌干细胞拓扑异构酶Ⅱα表达的影响

目的探讨补骨脂素对乳腺癌干细胞拓扑异构酶Ⅱα(topoisomerase,TopoⅡα)表达的影响。方法选用乳腺癌多药耐药细胞株(MCF-7/ADR)为模型,用免疫磁珠法筛选乳腺癌干细胞;运用光学显微镜观察乳腺癌干细胞生长状态;用CCK-8法检测补骨脂素对乳腺癌干细胞的毒性作用以及阿霉素和阿霉素与补骨脂素联合用药组对乳腺癌干细胞的IC50,计算逆转倍数;运用RT-PCR检测拓扑异构酶Ⅱα基因mRNA表达水平;运用Western blot法检测拓扑异构酶Ⅱα蛋白表达水平。结果在光学显微镜下,乳腺癌干细胞呈球形生长;补骨脂素对乳腺癌干细胞的IC10为(6.77±0.23)μg/mL,IC20为(10.36±0.21)μg/mL;阿霉素对乳腺癌干细胞的IC50为(90.03±3.56)μg/mL,阿霉素与补骨脂素联合用药对乳腺癌干细胞的IC50为(21.47±0.82)μg/mL,逆转倍数为4.19倍;补骨脂素处理后,拓扑异构酶Ⅱα基因mRNA表达水平均升高,与对照组相比,6μg/mL组升高1.9倍(P=0.008,差异有统计学意义),10μg/mL组升高2.7倍(P=0.000,差异有统计学意义);补骨脂素处理后,拓扑异构酶Ⅱα蛋白表达均升高,与对照组相比,6μg/mL组升高1.8倍(P=0.003,差异有统计学意义),10μg/mL组升高2.4倍(P=0.000,差异有统计学意义)。结论补骨脂素能够上调乳腺癌干细胞拓扑异构酶基因和蛋白的表达,增加药物的作用靶点,逆转乳腺癌干细胞对阿霉素的耐药。     

Nac-1在神经干/祖细胞自我更新维持中的作用

目的研究Nac-1在神经干/祖细胞(NSPCs)自我更新维持中的作用及其机制。方法以胚胎干细胞(ESCs)来源的NSPCs为细胞模型,利用RNA干扰法敲低Nac-1表达并通过定量RT-PCR和Western blot检测干扰效率;通过细胞计数和流式细胞技术,检测NSPCs的增殖和凋亡情况;并利用荧光素酶等实验检测Nac-1对c-Myc的转录调控作用。结果 Nac-1在NSPCs中高表达,分化后其mRNA水平下降了77%。与对照组相比,实验组(干扰组)NSPCs中Nac-1的mRNA水平显著下降,干扰效率分别是69%和66%。Nac-1敲低组的NSPCs增殖缓慢,凋亡增多,趋向于分化,c-Myc的mRNA水平降低46%和57%。荧光素酶分析显示,Nac-1敲低组中,c-Myc启动子的活性下降了24%和36%,提示Nac-1可以调节c-Myc基因的启动子活性。结论Nac-1促进NSPCs增殖并抑制其分化,是NSPCs自我更新维持所必需;Nac-1促自我更新的作用可能通过调控c-Myc的转录而实现。     

糖尿病心肌缺血大鼠骨髓干细胞动员及心肌组织细胞因子的表达

目的探讨糖尿病心肌缺血大鼠外周血骨髓干细胞动员和归巢的变化以及缺血心肌组织中血管内皮生长因子和肿瘤坏死因子α的表达变化。方法首先采用链脲佐菌素腹腔注射建立雄性SD大鼠糖尿病模型,然后通过开胸结扎冠状动脉左前降支建立糖尿病心肌缺血模型,并分为缺血1d组、缺血3d组、缺血7d组、缺血28d组;另设相应时间点的糖尿病对照组(开胸但不进行动脉结扎)和正常对照组(不进行腹腔注射和动脉结扎),每组6只。应用流式细胞术测定各组大鼠的外周血单个核细胞中CD34+细胞百分率;应用免疫组化法观察各组动物缺血心肌中CD34+细胞归巢以及血管内皮生长因子和肿瘤坏死因子α的表达。结果大鼠糖尿病心肌缺血组于术后出现骨髓干细胞动员,1周内达高峰,随时间延长减弱;同时术后1周内缺血心肌组织中相应地出现骨髓干细胞归巢以及血管内皮生长因子和肿瘤坏死因子α表达明显增加。结论糖尿病缺血心肌早期可通过组织局部血管内皮生长因子和肿瘤坏死因子α表达升高而动员骨髓干细胞进入外周血,并归巢至缺血心肌,从而启动自体保护机制。     

大鼠骨髓间充质干细胞定向成骨细胞分化中碱性磷酸酶的变化

目的　研究大鼠骨髓间充质干细胞药物诱导定向成骨细胞分化特性及分化过程中碱性磷酸酶的变化。方法　用质量浓度为 1.0 73kg·L-1的Percoll分离骨髓间充质干细胞 ,再连续进行 3次换液以纯化骨髓间充质干细胞。加药物 β 甘油磷酸钠、地塞米松和维生素C诱导骨髓间充质干细胞定向成骨细胞分化。在加药后 5、10、15、2 0d用比色法检测细胞中碱性磷酸酶含量。改良Gomori染色 ,统计阳性细胞百分率。结果　梯度密度离心和黏附贴壁法联合使用可得到均一的骨髓间充质干细胞。用比色法测得在第 5、10、15、2 0d ,碱性磷酸酶含量 (A40 5)分别为 0 .391± 0 .0 2 14、0 .4 345± 0 .0 2 31、0 .8781± 0 .0 2 96和 0 .933± 0 .0 2 36 ;对照组为 0 .16 5 6± 0 .0 2 4 2、0 .15 2 8± 0 .0 2 15、0 .14 5 3± 0 .0 2 0 4和 0 .14 35± 0 .0 2 16。同时期改良Gomori染色阳性细胞率分别为 10 .35 %、11.4 8%、35 .2 8%和 4 6 .7%。结论　大鼠骨髓间充质干细胞经药物诱导后可以分化成成骨细胞。在分化过程中碱性磷酸酶含量从给药后的 10d左右才开始显著升高。在此过程中改良Gomori染色结果与其保持一致     

乳腺癌干细胞向血管内皮细胞分化及血管形成的实验研究

目的探讨乳腺癌干细胞向血管内皮细胞分化的潜力及参与肿瘤血管形成的作用。方法收集人乳腺癌组织样本,检测肿瘤血管中突变型P53、CD31、VEGF的表达及Her-2扩增;制备乳腺癌单细胞悬液,分选出CD44~+/CD24-/low细胞,以培养体系为EGM-2内皮细胞培养基培养,检测其内皮细胞表面标志CD31和CD105的表达和摄取乙酰化低密度脂蛋白的能力,体外进行三维胶培养,观察其脉管样结构。结果乳腺癌组织样本中均可观察到CD31、VEGF、突变型P53的表达,并沿着血管腔或血管球排列;免疫荧光显示乳腺癌组织血管内表达CD31和DAPI信号;在13例所取样本中检测到Her-2阳性扩增4例,未扩增9例。分离成功的乳腺癌干细胞进行免疫磁珠分选,分选前CD44~+细胞比例[(7.5±2.6)%]明显低于分选后[(94.3±4.7)]%,差异具有统计学意义(P<0.05);分选前CD24~+细胞比例[(48.2±9.4)%]明显高于分选后[(4.3±1.6)%],差异具有统计学意义(P<0.05)。乳腺球细胞中CD105~+细胞比例为(4.5±0.9)%,CD31~+细胞比例为(6.2±1.3)%;经内皮细胞培养体系持续培养3代后,CD105~+和CD31~+细胞比例分别为(79.6±9.3)%和(84.1±10.7)%,差异有统计学意义(P<0.05)。经内皮细胞培养体系培养后的细胞能吞噬DiL-Ac-LDL,内皮细胞组可见有脉管样结构形成,而对照组无脉管样改变的趋势。结论乳腺癌干细胞来源的内皮细胞可分化为血管内皮细胞并具有脉管形成的能力,提示乳腺癌干细胞可能参与肿瘤血管的形成。     

经血来源干细胞移植在小鼠卵巢早衰模型中的定位分布

目的探讨经血来源干细胞(menstrual-derived stem cells,MenSCs)移植在卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)小鼠模型中的分布及生长情况。方法通过腹腔注射顺铂构建POF小鼠模型,90只8周龄雌性C57/BL6小鼠随机分为3组,MenSCs移植组:利用携带绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因的慢病毒感染MenSCs进行标记,建模后经尾静脉注射GFP标记的MenSCs悬液(5.0×107个/mL)200μL;POF组:建模后小鼠尾静脉注射等量PBS;空白对照组:正常小鼠不予任何处理仅尾静脉注射等量PBS。观察移植后各组小鼠的一般情况,移植后第10天处死小鼠测定血清FSH和E2浓度、检测卵巢组织学变化、卵泡计数以及检测GFP荧光信号在卵巢内的分布和定位情况。结果建模后小鼠与空白对照组小鼠比较体质量减轻、食欲减退、活动减少,POF组小鼠FSH水平显著增高,E2水平显著降低,卵巢间质纤维化明显,各级卵泡数均显著减少。MenSCs移植组小鼠自移植后体质量逐渐增加,食欲增强,活动增多,移植后第10天FSH浓度显著低于POF组;E2浓度显著高于POF组;原始卵泡、生长卵泡及成熟卵泡数均显著高于POF组,卵巢间质纤维化程度较POF组减轻,但各项指标仍与空白对照组间存在差异。荧光显微镜下可见GFP-MenSCs定位于卵巢间质,未见于卵泡及颗粒细胞,肝脏、肾脏、肺组织未见GFP绿色荧光信号。结论 MenSCs移植可向POF小鼠卵巢归巢,定位于卵巢间质,对卵巢组织结构及内分泌功能起到修复作用。     

苯妥英钠对大鼠牙周膜干细胞迁移及成骨分化的影响

目的在体内微环境中研究局部应用苯妥英钠对大鼠牙周膜干细胞迁移及成骨分化的影响。方法 54只SD雄性大鼠建立下颌骨创伤模型,创伤局部使用预定浓度的苯妥英钠,将大鼠随机分为实验组和对照组。实验组于术后通过舌下静脉注入BrdU标记的大鼠牙周膜干细胞,对照组于术后通过舌下静脉注入等量的PBS,每组每个浓度分别于术后1、2、4周时腹腔麻醉后脱颈处死大鼠3只,采用免疫组织化学染色和图像分析软件测定创伤区BrdU、骨桥蛋白(OPN)、RUNX2的表达,并用SPSS 18.0统计分析软件进行多因素方差分析。结果 40μg/mL PHT+rPDLSCs组和100μg/mL PHT+rPDLSCs组BrdU阳性细胞数明显多于20μg/mL PHT+rPDLSCs组与rPDLSCs,差异有统计学意义(P<0.05);40μg/mL和100μg/mL PHT+rPDLSCs与rPDLSCs相比、PHT和空白组相比、PHT+rPDLSC与PHT相比差异有统计学意义(P<0.05);40μg/mL和100μg/mL PHT组OPN和RUNX2的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论 40μg/mL和100μg/mL PHT在骨组织修复的早期可以促进缺损附近的牙周膜干细胞迁移至缺损区域,并增殖分化为成骨细胞,促进骨组织的愈合。     

带蒂脂肪瓣及神经根包裹术在神经根型骶管囊肿手术中的应用

目的探讨带蒂脂肪瓣及神经根包裹术在神经根型骶管囊肿手术中的应用及注意事项。方法回顾分析我科收治的14例神经根型骶管囊肿的手术指证、手术技巧及术后恢复情况。结果在显微镜及神经电生理监测的辅助下,14例患者,囊壁全切9例,囊壁包裹6例,全切率64.3%,术后症状明显改善。结论神经根型骶管囊肿手术中采用带蒂脂肪瓣及神经包裹术,可以有效保护神经根,提高手术的成功率并显著降低复发比例。