融合标签技术及其应用

融合标签技术是一种基于报告基因的重组DNA技术,融合标签技术的发展使重组蛋白质的纯化、固定及检测更加快速、简便,并很快得到了应用。     

抗人γ-精浆蛋白V_H单域抗体/人p53四价功能域融合基因的构建及空间构象分析

目的　构建抗人γ 精浆蛋白 (γ Sm)重链可变区 (VH)单域抗体 /人 p5 3四价功能域融合基因 ,并进行空间构象分析。方法　选用人IgG3上游铰链区作为抗体和人p5 3四价功能域之间连接的linker。利用回归PCR法扩增人IgG3上游铰链区与人p5 3四价功能域融合基因 ,并在融合基因 5’端和 3’端引入SalⅠ与HindⅢ酶切位点 ,将融合基因克隆入 pUC1 9载体中构建pUC1 9/IgG3 /p5 3克隆载体。将抗人γ SmVH 单域抗体克隆入 pUC1 9/IgG3 /p5 3载体中 ,构建抗人γ SmVH 单域抗体 /人 p5 3四价功能域融合基因。经酶切鉴定及序列测定证实后 ,利用计算机软件进行空间构象分析。结果　获得了抗人γ SmVH 单域抗体 /人 p5 3四价功能域融合基因 ,基因全长 5 2 8bp ,可编码 1 76个氨基酸 ,与已发表的抗人γ SmVH 单域抗体、人IgG3上游铰链区和人p5 3四价功能域基因cDNA序列一致。计算机软件分析结果显示 ,融合基因表达产物可自动装配成四聚体抗体 ,并具有四条长的、柔性好的多肽 ,可确保每个抗体空间构象的独立性。结论　构建成功四价抗人γ SmVH 单域抗体 ,为进一步临床应用奠定基础。     

人硫氧还蛋白cDNA的克隆及序列测定

目的　克隆人硫氧还蛋白 (HumanThioredoxin ,hTRX)cDNA序列并进行序列测定。方法　应用RT PCR技术 ,以 1 43(TK- )人骨肉瘤细胞RNA为模板 ,扩增出hTRX成熟蛋白的cDNA基因 ,并克隆至 pGEM TEasy载体中进行基因序列测定。结果　将所得序列与GenBanK(J0 4 0 2 6)提供的序列比较 ,其酶活性中心 (Trp Cys Gly Pro Cys)和基序与已知序列一致 ,第 1 80、2 84位碱基与已知序列不同 ,编码的氨基酸也发生了改变。结论　克隆得编码hTRX成熟蛋白的cDNA基因 ,为进一步探讨hTRX的生物活性和应用奠定了基础。     

乳腺癌p16和p53蛋白的表达及意义

目的　探讨p1 6蛋白和p53蛋白在乳腺癌中的表达及意义。方法　应用免疫组化ABC法检测了 74例乳腺癌 p1 6蛋白和p53蛋白的表达情况。结果　 74例乳腺癌 p1 6蛋白阳性表达率43 2 % ;在不同组织学分级的乳腺癌中p1 6蛋白阳性率分别为Ⅰ级 1 1 1 % ,Ⅱ级 50 % ,Ⅲ级 44 8% ,其各组间差异无统计学意义 (P >0 0 5)。 74例乳腺癌p53蛋白的阳性率为 44 6% ;p53蛋白阳性表达与乳腺癌组织学分级明显相关 ,其阳性率分别为Ⅰ级 2 2 2 % ,Ⅱ级 30 6% ,Ⅲ级 69 0 % ,Ⅲ级明显高于Ⅰ级 (P <0 0 1 )和Ⅱ级 (P <0 0 1 )。乳腺癌 p1 6蛋白与p53蛋白表达之间无明显相关。结论　p1 6蛋白的失表达 ,突变型p53蛋白的过表达均与乳腺癌发生发展有关 ,它们通过不同途径发挥生物学作用 ,p53蛋白表达对评估乳腺癌的分化程度和判断预后具有一定价值。     

不同设计的两代国产铂铱合金支架对兔颈动脉血管反应的影响

目的　评估不同金属丝直径、不同结构设计的国产铂 铱合金支架对血管反应的影响。方法　将家兔分为三组 ,第一组置入直径 0 .1 3mm单丝缠绕成螺旋形结构的第一代支架 (n =5) ,第二组置入直径 0 .1 75mm单丝缠绕成“之”字形结构的第二代支架 (n =5) ,第三组置入第二代明胶蛋白涂层支架 (n =7)。术后 7d行病理形态分析及扫描电镜观察。结果　所有动物均成功置入支架 ,组织病理学检查显示 :一代和二代支架组各有 1例不完全性血栓形成 ;涂层支架组无血栓形成。支架置入血管无明显炎症反应和异物巨细胞聚集。涂层支架组平均新生内膜厚度与新生内膜面积最小 ,而管腔面积最大 (P均 <0 .0 5)。扫描电镜显示支架表面几乎完全内皮化。结论　支架金属丝直径与结构设计的不同对新生内膜增殖及管腔面积有影响 ;明胶蛋白涂层具有良好的组织相容性。     

抗人γ-精浆蛋白VH单域抗体基因的构建、表达及空间构象分析

目的扩增出抗人γ-精浆蛋白(γ-Sm)单克隆抗体(mAb)的重链可变区(VH)单域抗体基因,并进行原核表达及空间构象分析。方法从分泌抗γ-SmmAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA,经RT-PCR扩增VH单域抗体基因,将其克隆到融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中进行表达,并利用计算机软件对表达产物进行空间构象分析。结果VH单域抗体基因全长363bp,含起始码和终止码。将其克隆到pGEX-4t-1内,转化大肠杆菌DH5α,获得高效表达,表达量占全菌总蛋白质的38％,以包涵体形式存在。经初步纯化和复性后,用谷胱甘肽(GST)亲和色谱纯化,再经凝血酶水解获得抗γ-SmVH单域抗体。竞争结合抑制实验证明,该表达产物具有前列腺癌细胞亲和活性。空间构象分析结果显示,该抗体具有完整的抗原结合位点。结论构建成功抗γ-Sm的VH单域抗体,为进一步临床应用奠定基础。     

FTO减少DKK2的m6A修饰和促进DKK2表达而减少心肌纤维化

目的 探讨肥胖相关蛋白(FTO)在心肌纤维化过程中与dickkopf2(DKK2)的N⁶甲基腺苷(m⁶A)修饰、表达水平间的关系。方法 心肌成纤维细胞分为对照组、AngⅡ处理组、AngⅡ+EV组(空载体和阴性siRNA转染后用AngⅡ处理)、AngⅡ+FTO-O组(FTO过表达载体转染后用AngⅡ处理)和AngⅡ+FTO-O+DKK2 siRNA组(FTO过表达载体和DKK2 siRNA共转染后用AngⅡ处理);小鼠按对照组(假手术组)、AMI组(构建急性心肌梗死模型)、AMI+EV组(AMI小鼠腹腔注射含空载体的纳米颗粒)和AMI+FTO-O组(AMI小鼠腹腔注射含FTO过表达载体的纳米颗粒)进行处理。用荧光定量PCR和Western blotting检测FTO、DKK2的表达,RNA结合蛋白免疫沉淀检测DKK2的m⁶A修饰水平,CCK-8检测细胞存活力,评估AMI小鼠的心功能,HE和Masson染色检测小鼠心脏病理变化。结果 AngⅡ抑制FTO的表达,进而增强DKK2的m⁶A修饰水平而下调DKK...     

沉默SPARC基因抑制高氟介导的甲状腺细胞凋亡

目的研究富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARC)对高氟介导的甲状腺细胞凋亡的作用及可能机制。方法培养人甲状腺细胞Nthy-ori 3-1,给予不同浓度的NaF(0.1、1、10 mmol/L)处理24 h,通过实时定量PCR和蛋白印迹法评价SPARC的表达,确定后续实验NaF作用浓度。另将细胞分组进行实验:对照组、NaF组(1 mmol/L孵育24 h)、si-SPARC组(转染SPARC siRNA 48 h用NaF处理)和si-NC组(转染Negative control siRNA 48 h用NaF处理)。CCK-8法和乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞毒性;细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡率,蛋白印迹法检测活化caspase3(c-caspase3)和IGF-1R的蛋白表达。此外,将siSPARC和siIGF-1R共同转染至甲状腺细胞,通过评价细胞凋亡进一步探讨SPARC的作用机制。结果随着NaF的浓度增大,SPARC mRNA和蛋白表达均逐渐升高(P<0.05)。si-SPARC组细胞活性较si-NC组增高[(84.02±9.51)%vs.(58.31±6.86)%,P<0.05],且LDH释放率减少[(134.25±18.98)%vs.(195.18±23.50)%,P<0.05]。si-SPARC组较si-NC组细胞凋亡率减少[(124.67±19.44)%vs.(175.24±16.46)%,P<0.05]。此外,si-SPARC组(1.95±0.24 vs. 0.93±0.08,P<0.05)IGF-1R蛋白表达上调,抑制IGF-1R逆转SPARC对细胞凋亡的作用。结论沉默SPARC基因降低高氟介导的细胞毒性、抑制细胞凋亡,其机制可能是通过负调控IGF-1R实现的。     

血管紧张素Ⅱ对大鼠肺部纤维化的诱导机制

目的探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对大鼠肺部纤维化的诱导机制。方法 SPF级雄性Wistar大鼠30只,分为对照组、模型组、模型+AngⅡ组,每组10只。各组大鼠行HE染色,评价肺纤维化和肺泡炎症程度,RT-PCR检测Yes相关蛋白1(Yap1)、PDZ结合相关性转录共激活因子(TAZ)、Smad2/3和Ⅰ型胶原蛋白(Col-Ⅰ)mRNA相对表达水平。结果对照组大鼠肺组织在光学显微镜下可见肺泡壁完整,结构清晰,肺泡隔无增宽,支气管腔及肺泡腔内无炎性渗出物,肺泡无炎性改变;模型组大鼠肺组织镜下可见部分肺泡融合,肺组织结构紊乱,肺泡隔严重充血、水肿及炎细胞浸润;模型+AngⅡ组大鼠肺组织镜下可见肺间质呈现均匀增厚,炎症细胞浸润增多。模型组和模型+AngⅡ组肺纤维化和肺泡炎症程度评分均显著高于对照组(P<0.05),且模型+AngⅡ组肺纤维化和肺泡炎症程度评分均显著高于模型组(P<0.05)。模型组和模型+AngⅡ组Yap1、TAZ、Smad2/3和Col-ⅠmRNA和蛋白均显著高于对照组(P<0.05),且模型+AngⅡ组Yap1、TAZ、Smad2/3和Col-ⅠmRNA和蛋白均显著高于模型组(P<0.05)。结论 AngⅡ可能通过上调Hippo信号通路中Yap1的表达和TGF-β1/Smad信号通路中Smad2/3的表达,促进Ⅰ型胶原的合成,诱导大鼠肺纤维化。     

SHR-SP脑梗死后微血管形成与星形胶质细胞的关系

目的探讨自发性高血压大鼠(stroke-prone,spontaneously hypertensive,SHR-SP)脑梗死周围半暗区微血管形成及其构筑变化与星形胶质细胞的关系。方法建立SHR-SP脑梗死模型,从SHR-SP大鼠股静脉注入FITCdextran后在共聚焦显微镜下观察大鼠脑血管的构筑,测定微血管直径及分支数;通过免疫组织化学及免疫荧光染色法检测SHR-SP脑梗死周围半暗区GFAP、FⅧ的表达,测定其GFAP阳性细胞数、微血管密度(microvessel density,MVD),分析SHR-SP脑梗死周围半暗区星形胶质细胞数量与MVD、微血管直径及分支数的相互关系。结果 SHRSP在饮用高盐(13g/L NaCl)水溶液后第7周开始出现脑梗死;与对照组WKY比较,在SHR-SP脑梗死周围半暗区GFAP表达的阳性细胞数、MVD、微血管分支数显著升高,微血管直径显著增粗,且明显高于对侧半球相应区及非高盐饮水SHR-SP脑的相应区(P<0.01)。直线相关分析显示,GFAP表达的阳性细胞数与MVD及微血管直径及分支数呈正相关性(P<0.01)。结论高盐(13g/L NaCl)饮水可诱发SHR-SP发生脑梗死;在SHR-SP脑梗死周围半暗区,微血管形成及构筑的变化促使了星形胶质细胞的增生。