G250抗原肽与HBcAg融合基因原核表达载体的构建及表达蛋白的免疫分析

目的构建肾癌G250抗原肽与HBcAg重组基因的原核表达质粒pET28a(+)/C-G250肽-C,并通过大肠杆菌进行原核表达并纯化,分析表达融合蛋白的免疫原性及抗原性。方法 PCR扩增编码G250抗原中249～268氨基酸的基因片段,将G250肽插入去除主要免疫优势区的重组质粒pGEMEX/HBcAg中,获得重组质粒pGEMEX/C-G250肽-C,为更换酶切位点,以pGEMEX/C-G250肽-C为模板,PCR扩增C-G250肽-C基因片段,最终将目的基因亚克隆入原核表达质粒pET28a(+)中,IPTG诱导融合蛋白表达,利用Ni 2+-NTA亲和层析法纯化重组融合蛋白,SDSPAGE鉴定融合蛋白的表达,纯化后融合蛋白经腹腔注射免疫BALB/c小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清中抗体的滴度。结果酶切及基因测序鉴定证实融合基因正确重组于表达质粒pET28a(+)中,原核表达并纯化后,该分离纯化融合蛋白纯度达95%以上,其相对分子质量约为22.35。BALB/c小鼠经4次免疫后,所有小鼠血清中均可检测到抗体,免疫第6周其血清中抗体滴度可达到1∶5.12×105,抗G250肽抗体滴度达到1∶6.4×104,抗HBcAg抗体滴度不超过1∶4×103。结论成功构建肾癌G250抗原肽与HBcAg重组基因原核表达质粒pET28a(+)/C-G250肽-C,在大肠杆菌中可高效表达,纯化后融合蛋白具有较强的免疫原性,能诱导小鼠产生高滴度和高特异性的抗体。     

CHD4蛋白截短体融合蛋白的表达、纯化和鉴定

目的构建CHD4/Mi-2β基因的截短体原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达并对GST融合蛋白进行纯化和初步鉴定。方法采用PCR方法扩增CHD4/Mi-2β的染色质调节区(CHD4-C)、解螺旋酶模序(CHD4-H)及DNA结合区(CHD4-D)基因片段,将目的基因片段插入原核表达载体pGEX-5T构建带GST标签的重组质粒,阳性克隆行DNA序列测定。IPTG诱导GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H原核表达,谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白,并对融合蛋白Western blot鉴定。结果构建了3个CHD4/Mi-2β基因的截短体重组质粒;IPTG诱导显示,GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H融合蛋白主要以可溶性蛋白形式在细胞裂解液上清中表达,表达产物的相对分子质量分别为130、110、90ku。谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白,纯化产物的纯度最高可达94.5%。Western blot证实各融合蛋白与抗GST单克隆抗体发生特异性结合反应,分子质量与估计值相符,提示为GST融合表达的CHD4/Mi-2β截短体蛋白。结论成功纯化了较高纯度的GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H融合蛋白,为进一步研究CHD4蛋白在染色质重塑中的作用奠定了实验基础。     

无线遥控小车的设计与实现

随着电子技术的发展,无线遥控小车得到日益广泛的推广和应用,在现代社会中发展了巨大的作用。文章设计了无线遥控小车的上位机系统与下位机系统。上位机系统用来发送控制指令,通过点击软件界面的虚拟按键,借助USB转NRF24L01模块发送相应的指令,而下位机系统以MK60FN1M0VLQ15单片机为核心单元,负责接收控制系统的动作指令,实现小车的运动以及自动避障功能。     

美国海关如何实施装货前24小时提交货物申报的新规定（上）

美国海关“24小时提前舱单”的新规定已于2月1日正式实施,这对中美贸易、集装箱运输、港口作业、业务单证流程及海关监管程序等都将产生重大和深远的影响。业界人士虽能深切感受到新规引起的震动,但时至今日普遍对其具体要求及美国海关执行该规定的决心缺乏正确、完整的认识。他们大都通过圈内的零星传闻了解新规,其中不乏片面、误导和失真之处。有的托运人甚至把提前提供正确资料误以为是船公司的要求。各界的反应虽也见诸海运期刊、网站,但其中鲜有对新规本身作出正面介绍者。 本文作者长期从事一线业务工作,同时致力于理论探索。因此,这篇文章在分析大量最新官方资料的基础上,能够针对实务界的种种困惑作出较系统、深入的解答,并对美国下一步立法动态进行颇有见地的预测。相信其中对舱单申报程序的介绍对业界同仁们正确理解新规、少走弯路将不无裨益。 由于文章篇幅较长,本刊将分3期刊登。     

美国反恐行动涉及中国港航业——记《CSI》及《24小时新条例》的实施

经中美两国政府有关部门历时半年的数轮谈判与磋商,中国政府已同意在深圳港和上海港实施美国集装箱安全倡议(以下简称《CSI》)的措施。在中美双方即将签订《CSI》同意书之际,港航业内人士,很有必要了解《CSI》及其产生的背景、目前进展以及将对中国尤其是深圳港航业产生的影响。同时,鉴于已经实施数月的《24小时新条例》与《CSI》密切相关,本文中对两者关系也一并给出简要说明。     

脑益嗪抗运动病时大鼠脑中c—fos基因表达水平的变化

目的：探讨脑益嗪抗运动病作用的神经中枢机理与脑细胞ｃ－ｏｆｓ基因表达的关系。方法；采用正负交变加速度旋转刺激ＳＤ大鼠制备运动病模型，为运动病组；在脑益嗪组，ＳＤ大鼠预先注射脑益嗪，１小时后如运动病组进行旋转刺激；正常ＳＤ大鼠作为对照组。用ｃ－ｆｏｓ基因探针对３组大鼠的大脑皮质，小脑皮质及脑干前庭区进行原位杂交。用免疫组化方法检测３组大鼠脑组织中Ｆｏｓ蛋白的含量。观察运动病组大鼠和佃嗪组大鼠大脑皮质     

首次在中国举行的第24届世界港口大会开幕

首次在中国举行的第24届世界港口大会5月23日在上海隆重开幕。来自世界各国的国际港口协会(IAPH)会员单位、各国政府部门、世界著名船公司、知名港口运营商和货主单位，欧盟、世界银行、国际海关组织、国际疏浚协会、国际引航组织等的领导和代表，以及国内各港口、企业和部门的代表共1000多人与会。     

miR-185*对癫痫海马神经元中BDNF-TrkB通路表达的影响

目的研究海马神经元癫痫模型中的BDNF/TrkB信号通路及miR-185*对其的调控。方法构建miR-185*表达载体。体外培养海马神经元,7d后将其随机分为正常组、癫痫组、正常+BDNF组、癫痫+BDNF组、正常转染miR-185*组、癫痫转染miR-185*组、癫痫转染miR-185*+BDNF组。免疫荧光、膜片钳及免疫印迹技术观察转染miR-185*后BDNF/TrkB通路的表达变化。结果癫痫+BDNF组海马神经元细胞的TrkB蛋白磷酸化水平较正常+BDNF组降低,有统计学意义(P<0.05);正常+BDNF组TrkB蛋白的磷酸化水平比正常组的磷酸化水平升高,有统计学意义(P<0.001);癫痫+BDNF组TrkB蛋白磷酸化水平比癫痫组升高,有统计学意义(P<0.05);而癫痫+miR-185*+BDNF组的TrkB蛋白磷酸化水平较癫痫+BDNF组和癫痫转染miR-185*组升高(P<0.001)。结论BDNF可以激活BDNF/TrkB信号通路,转染miR-185*后可以消除对癫痫状态下BDNF/TrkB信号传导通路的抑制。     

NT4p53(C22)Ant融合基因重组腺病毒的构建及对肝癌细胞的杀伤作用

目的构建编码融合基因NT4p53(C22)Ant嵌合肽的重组腺病毒表达载体,并研究其对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用。方法使用分子克隆技术,通过同源重组获得重组腺病毒rAVV-NT4p53(C22)Ant,收集上清、大量扩增并测定其滴度。感染人肝癌HepG2细胞,采用免疫组化法检测p53表达,MTT实验、流式细胞仪观察rAAVNT4p53(C22)Ant对肿瘤细胞的杀伤作用。结果成功构建重组腺病毒表达载体,感染人肝癌HepG2细胞后p53表达率为(44.88±2.45)%;MTT检测显示,细胞存活率随作用时间延长明显降低,与空病毒组及对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),流式细胞仪检测显示G0/G1期细胞比例及凋亡细胞较空病毒组及对照组增加。结论构建的NT4p53(C22)Ant重组腺病毒在肝癌细胞中能有效表达,对肝癌HepG2细胞有抑制增殖和促进凋亡的作用。