慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白筛选稳定转染的兔骨髓间充质干细胞

目的分离、培养并鉴定兔骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs),探讨慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)感染兔BMSCs的最佳条件,筛选稳定转染的兔BMSCs。方法通过全骨髓贴壁法获得兔BMSCs;茜素红、甲苯胺蓝及油红O染色对BMSCs成骨、成软骨及成脂分化进行鉴定;免疫荧光组化染色检测CD44及CD90的表达;不同浓度嘌呤霉素筛选BMSCs的最小致死浓度;以感染复数(multiplicity of infection, MOI)为50、100、150、200的慢病毒载体介导eGFP转染BMSCs,倒置显微镜下观察荧光表达,并用嘌呤霉素筛出稳定转染系。结果当MOI为150,慢病毒载体介导eGFP感染兔BMSCs效率最高;嘌呤霉素筛选稳定转染兔BMSCs的最适质量浓度是1.0μg/mL。结论成功培养了兔BMSCs,用慢病毒介导的GFP标记了兔BMSCs并筛选出了稳定转染的兔BMSCs,建立了一个简便有效的干细胞标记方法,为BMSCs在动物体内实验标记示踪奠定了基础。     

骨髓间充质干细胞来源外泌体miR-30e-5p改善高血糖诱发的肾小管上皮细胞的焦亡

目的 探讨骨髓间充质干细胞外泌体(BMSC-exos)miR-30e-5p对高葡萄糖(HG)诱导的体外培养的人肾近端小管细胞(HK-2)焦亡的影响,并探索治疗糖尿病肾病(DKD)的替代方法。方法 BMSC-exos分离并内化到HG处理的HK-2细胞中,测定细胞生存能力和细胞毒性。通过流式细胞仪方法评估细胞焦亡,检测miR-30e-5p、IL-1β和IL-18的表达水平,通过Western blotting蛋白质印迹分析测定焦亡相关的细胞因子蛋白。结果 BMSC-exos降低了LDH、IL-1β和IL-18的分泌,改善焦亡情况,并抑制了HG诱导的HK-2细胞中的焦亡相关因子(IL-1β、胱天蛋白酶-1、GSDMD-N和NLRP3)的表达。miR-30e-5p敲除逆转了BMSC-exos对HK-2细胞焦亡的改善作用。结论 BMSC-exos的miR-30e-5p抑制HG处理的HK-2细胞焦亡,这可能为治疗DKD提供一种新的策略。     

相关蛋白在携带载脂蛋白-J基因大鼠BMSCs中的表达及意义

目的检测重组质粒pEGFP-N1-apoJ在不同量、不同时间条件下转染大鼠骨髓间充质干细胞的瞬时转染效率,并测定载脂蛋白-J(ApoJ)在靶细胞中能否高表达。方法贴壁培养细胞,并用脂质体LipofectaminTM2000分别介导0.8、1.2、1.6、2.0μg重组质粒pEGFP-N1-apoJ转染,置荧光显微镜下观察转染结果,测定在24、48、72h时间点的瞬时转染效率。蛋白免疫印迹法分别检测pEGFP-N1-apoJ质粒转染组、空pEGFP-N1质粒转染组、空白对照组ApoJ的表达情况。结果不同的质粒量中1.6μg pEGFP-N1-apoJ质粒与3.0μL脂质体制备的复合物瞬时转染效率最高,分别作用24、48、72h可达27.8%、34.3%、28.2%。蛋白免疫印迹法检测到pEGFP-N1-apoJ质粒组大量ApoJ表达,空质粒及空白对照组见微量ApoJ表达;并且pEGFP-N1-apoJ质粒组Apo-J的表达明显高于空载体及空白对照组(P<0.05)。结论利用脂质体介导可将重组质粒pEGFP-N1-apoJ成功转染入大鼠骨髓间充质干细胞,ApoJ在大鼠骨髓间充质干细胞中得到大量表达。     

苯妥英钠对大鼠骨髓间充质干细胞与血管内皮细胞VEGF和SCF分泌的影响

目的研究苯妥英钠(PHT)对大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)和血管内皮细胞(rVECs)间接共培养体系中血管内皮细胞生长因子(VEGF)和干细胞因子(SCF)分泌的影响。方法分别建立rBMSCs、rVECs单独培养组及共培养组,各组添加不同质量浓度的PHT(0、20、40μg/mL)。在培养第2、4、6天时,用双抗体夹心ABC-ELISA法检测培养上清中VEGF和SCF的含量。结果 1VEGF:培养第二天时,在相同PHT作用下,共培养组VEGF含量高于rBMSCs单独培养组(P<0.05)和rVECs单独培养组(P<0.001);共培养组随着培养时间的延长和PHT浓度增大VEGF含量增加(P<0.001,P<0.05)。2SCF:共培养组SCF含量高于相同PHT浓度下的单独培养组;在共培养组中,当PHT为20μg/mL时,随着培养时间延长SCF含量增加;当PHT为40μg/mL时,随着培养时间延长SCF含量减少,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论 PHT可促进rBMSCs与rVECs共培养体系中VEGF的分泌,可能降低SCF的分泌。     

骨髓间充质干细胞对大鼠心肌梗死后心肌营养素-1的影响

目的观察大鼠心肌梗死后心肌营养素-1(CT-1)的表达,并用骨髓间充质干细胞移植对其干预,探讨CT-1与心室重塑之间的关系。方法随机选取Wistar雄性大鼠50只,10只作为假手术组(A组);40只作为心肌梗死组,结扎左冠状动脉前降支(LAD)致心肌梗死24h后,分别随机抽取一半数量存活大鼠作为心肌梗死对照组(B组)及BMSC移植干预组(C组)。BMSC移植干预组(C组)通过尾静脉注射1mL BMSC细胞悬液于大鼠体内;A组、B组分别注射无血清培养液DMEM 1mL,6周后采用Real time PCR及免疫组化、Western blotting分别检测非梗死区CT-1的mRNA及蛋白表达量。结果 6周后,B组非梗死区心肌样本中,CT-1mRNA及蛋白表达量、左心质量指数,同A、C组相比均显著升高,且差异有统计学意义(P<0.05);C组非梗死区心肌中CT-1mRNA及其蛋白含量、左心室质量指数均较A组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与B组相比,C组以上指标则明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论骨髓间充质干细胞能够抑制大鼠心肌梗死后CT-1mRNA及蛋白表达,从而改善心肌重构。     

沉默HLA A2表达的骨髓间充质干细胞安全性的研究

目的探讨人白细胞抗原A2(HLA A2)表达沉默后人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)的安全性。方法实验分为对照组(正常培养至第8代细胞组)及实验组1和实验组2(分别为HLA A2表达沉默后第5代、第15代)。复苏HLA A2表达沉默的hBMSCs,通过观察细胞的生长曲线、端粒酶活性和抑癌基因P27的表达水平、细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)和Cyclin D2的表达水平,分析细胞的安全性。并将细胞接种于裸鼠的皮下,24周后观察荷瘤组织的种类。结果实验组1、实验组2与对照组相比,细胞生长曲线没有明显的左移或右移。HLA A2表达沉默的hBMSCs在沉默HLA A2表达后,3组间的端粒酶活性没有明显差异;3组的Cyclin D2、CDK4和抑癌基因P27的表达量也没有明显变化。细胞接种于裸鼠皮下24周,只有异位成骨,而没有形成肿瘤组织。结论人BMSCs的HLA A2表达沉默后,在实验周期内,没有明显证据表明有安全性的改变。     

港口上市企业：秋凉迅猛入骨髓

上半年，沿海港口上市企业均出现明显的业绩“拐点”，或预示着港口企业的高速增长已进入尾声。     

同种异体骨髓基质干细胞移植治疗大鼠肺动脉高压模型的实验研究

目的研究大鼠骨髓基质干细胞(rBMSCs)对大鼠肺动脉高压的治疗作用及其机制。方法采用有利于rBMSCs生长及增殖的全骨髓贴壁法分离及培养干细胞;利用野百合碱制备肺动脉高压模型。健康SD大鼠26只,6只作为对照组,给予等量生理盐水腹腔注射;12只作为肺动脉高压模型组,每只大鼠腹腔注射野百合碱60mg/kg;8只作为干细胞治疗组均给予野百合碱(60mg/kg)腹腔注射,同时给予rBMSCs尾静脉注射。4周后观察大鼠的生长情况,测右心室压力及右心室肥大指数,比较肺脏病理变化及肺组织均浆中内皮素-1(ET-1)含量的变化。结果模型组大鼠右心室压力、右心室肥大指数、组织中ET-1含量明显高于对照组(P<0.05);干细胞治疗组较模型组显著降低(P<0.05);肺组织病理切片显示模型组肺血管重构明显,而治疗组肺血管重构减轻。结论骨髓基质干细胞可能通过抑制ET-1的产生,从而抑制肺血管重构,显著降低肺动脉高压大鼠模型的右心室压力。     

体内心肌缺血微环境下大鼠骨髓间充质干细胞钾离子通道的表达

目的动态观察在体内心肌缺血微环境下,大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)向心肌细胞分化过程中主要钾离子通道的分化表达。方法采用左冠状动脉前降支(left anterior descending coronary artery,LAD)结扎术建立大鼠急性心肌梗死(myocardial infarction,MI)模型(n=60),将绿色荧光蛋白(green fluorescent pro-tein,GFP)标记的MSCs,心外膜下注射移植到心肌梗死周边区;免疫荧光染色观察移植后3d(MI-3d组)、5d(MI-5d组)、7d(MI-7d组)、9d(MI-9d组)MSCs的存活情况及其主要钾离子通道(Kv1.4、Kir2.1、Kv4.3、Kca1.1)蛋白的表达;应用激光捕获显微切割技术分离以上各组心肌组织中GFP标记的MSCs群,应用Real-time PCR测定其Kv1.4、Kir2.1、Kv4.3、Kca1.1的mRNA表达。结果免疫荧光染色观察到移植的MSCs于移植后第3天开始持续表达Kv1.4、Kir2.1、Kv4.3,不表达Kca1.1,于移植后第9天几乎未观察到MSCs;Real-time PCR结果显示移植后3、5、7d,移植的MSCs上Kv1.4和Kir2.1表达呈逐步增多趋势,差异具有统计学意义(P<0.05),Kv4.3的表达无此变化趋势,但高于未移植MSCs,未见明显差异。结论移植的MSCs在大鼠体内心肌缺血微环境下向心肌细胞分化的过程中能够表达部分钾离子通道表型,但其不能长时间、有效的存活。     

麝香酮含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞的增殖、分化的影响

目的研究麝香酮含药血清对骨髓间充质干细胞(BMSCs)的增殖及其向成骨细胞分化的影响,初步了解麝香酮单体对骨髓间充质干细胞的作用机制。方法贴壁筛选法提取大鼠BMSCs,培养至第3代,流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨成脂诱导,鉴定认为培养成功后,利用制备的不同浓度麝香酮含药血清干预。测定细胞增殖率、碱性磷酸酶(ALP)活性、钙盐沉积量、骨钙素分泌量等,研究麝香酮含药血清对大鼠干细胞增殖、分化的影响。结果筛选纯化的BMSCs呈均一的成纤维细胞样,贴壁生长,以长梭形为主;表型鉴定:CD45阴性,CD44、CD95均呈阳性表达;用含药血清干预后的增殖率、ALP活性、钙盐沉积量、骨钙素分泌量、钙化结节量均高于空白对照组。结论麝香酮含药血清可以促进BMSCs的增殖、成骨分化。