白藜芦醇通过诱导细胞周期阻滞及细胞凋亡增强宫颈癌细胞的化疗敏感性

目的探索白藜芦醇(resveratrol)对宫颈癌细胞化疗敏感性的影响及其调控机制。方法 Hela/DDP细胞分为4组:Hela/DDP组,resveratrol组,顺铂(cisplatin,CDDP)组,resveratrol+CDDP组。CCK-8检测细胞活力及增殖。流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡。Western blot检测p21、CDK2、cyclinD1、caspase-9、caspase-3、Bcl-2和Bax表达。结果 Hela/DDP细胞对CDDP的敏感性低于Hela细胞(P<0.01)。白藜芦醇可增强Hela/DDP细胞对CDDP的敏感性(P<0.01)。白藜芦醇可提高CDDP对Hela/DDP细胞增殖的抑制作用(P<0.01)。白藜芦醇可增强CDDP对Hela/DDP细胞G1期阻滞作用(P<0.01)。resveratrol组和CDDP组p21表达高于Hela/DDP组,CDK2和cyclinD1低于Hela/DDP组(P<0.01)。与CDDP组相比,resveratrol+CDDP组p21表达升高,CDK2和cyclinD1表达降低(P<0.01)。白藜芦醇可提高CDDP对Hela/DDP细胞凋亡的诱导作用(P<0.01)。resveratrol组和CDDP组caspase-3、caspase-9和Bax表达高于Hela/DDP组,Bcl-2表达低于Hela/DDP组(P<0.01)。与CDDP组相比,resveratrol+CDDP组caspase-3、caspase-9和Bax表达升高,Bcl-2表达下降(P<0.01)。结论白藜芦醇可能通过诱导细胞周期阻滞及细胞凋亡而增强宫颈癌细胞的化疗敏感性。     

沉默血小板反应蛋白-1基因对亚溶解型C5b-9诱导肾小球系膜细胞分泌细胞外基质的影响

目的研究沉默血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1,TSP-1)基因对于亚溶解型(sublytic)C5b-9复合物诱导大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)分泌细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的影响。方法设计合成针对TSP-1基因4个靶点的小发夹RNA(small hair RNA,shRNA),并构建相应的表达质粒,筛选沉默效率最佳的TSP-1shRNA(shTSP-1)后,将shTSP-1转染体外培养的大鼠GMC,再给予sublytic C5b-9刺激。以Westernblot检查TSP-1、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)及Ⅳ型胶原蛋白(collagenⅣ)的表达情况。另用ELISA法测定培养上清中总转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和活化TGF-β1的含量。结果核酸序列分析证明,4种TSP-1shRNA重组质粒均构建成功。Western blot实验证实,构建的shTSP-1-3(Thbs1-3)具有最佳的沉默效率。将shTSP-1-3转染大鼠GMC后,在沉默TSP-1基因表达的同时,能明显抑制由sublytic C5b-9诱导的TGF-β1活化及细胞外基质(FN和collagenⅣ)的合成。结论 TSP-1基因表达在sublytic C5b-9刺激大鼠GMC诱导TGF-β1活化及ECM分泌的过程中,发挥了重要的促进作用。     

鼻咽癌组织中BCRF-1基因表达及其与免疫功能的相关性分析

目的研究鼻咽癌组织中BCRF-1mRNA及病毒白介素-10(VIL-10)蛋白质的表达,明确VIL-10对鼻咽癌患者免疫细胞的影响。方法在鼻咽癌组织和鼻咽炎症组织中,分别应用RT-PCR及Western Blot检测BCRF-1mRNA和蛋白产物VIL-10的表达;流式细胞术检测两组患者外周血CD4+T、CD8+T细胞的比例。结果①BCRF-1mR-NA在34/40例(85%)鼻咽癌组织和16/20例(80%)鼻咽炎症组织中表达阳性,两者差异无统计学意义(P>0.05)。②30/40例(75%)鼻咽癌组织VIL-10呈阳性,10/20例(50%)鼻咽炎症组织VIL-10呈阳性,两者差异具有统计学意义(P<0.05)。③40例鼻咽癌患者分为VIL-10阳性组和VIL-10阴性组,VIL-10阳性鼻咽癌患者组CD4+T细胞及CD4+T/CD8+T比值明显低于VIL-10阴性鼻咽癌患者组(24.99%±3.88%vs.35.92%±6.31%,0.86 vs.1.99,均P<0.05),而VIL-10阳性鼻咽癌患者组CD8+T细胞明显高于VIL-10阴性鼻咽癌患者组(30.61%±3.34%vs.20.10%±7.68%,P<0.05)。结论鼻咽癌组织中高表达BCRF-1基因及其蛋白产物VIL-10;VIL-10使鼻咽癌患者的免疫细胞发生偏移,发挥免疫抑制作用。     

应用抑制性消减杂交技术筛选HBxAg蛋白结合蛋白XBP1的上调基因

目的应用酵母双杂交及生物信息学(bioinformatics)技术获得HBxAg蛋白结合蛋白XBP1,为了解该基因的反式调节机制,利用抑制性消减杂交技术筛选并克隆XBP1蛋白反式激活的靶基因。方法以XBP1表达质粒pcD-NA3.1(-)-myc-his(A)-XBP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)-myc-his(A)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并合成cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组,分别衔接两种不同接头,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次PCR反应,产物与T/A克隆载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR鉴定后进行测序及同源性分析。结果成功构建人XBP1蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA。扩增后得到80个200～1 000bp插入片段的克隆,随机挑选其中30个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得28个已知编码序列基因和2个未知的新基因。结论 XBP1在肝细胞内表达后能够上调HepG2细胞中许多不同基因表达的变化,这些基因与细胞信号转导、细胞增殖与分化、免疫应答、能量代谢、细胞凋亡、肿瘤发生等生物过程密切相关。     

细胞图像自动分割方法研究

提出一种细胞图像的自动分割与定位方法.首先将直方图分割所得二值图像的距离变换作为边缘提取的指导知识,进行细胞图像的精确分割;然后利用分割边缘点的梯度方向和几何知识确定细胞的中心.该方法既能对非重叠细胞也能对重叠细胞进行细胞的分割与定位.     

阿魏酸钠对兔激素性股骨头坏死早期的干预作用及对骨细胞凋亡的影响

目的探讨药物阿魏酸钠对于激素性股骨头坏死早期的干预作用及其对细胞凋亡的影响。方法利用改良的马血清加甲强龙的方法成功制备兔激素性股骨头坏死早期的动物模型。80只动物随机分为对照组、模型组和治疗组3组。分别选取激素注射后2、4、8、12周4个时间点,每组随机处死6只动物进行股骨头大体观察、HE染色、TUNEL凋亡染色、透射电镜观察,分析每组各时间点相关指标的变化情况以及各组之间的差异。结果大体观察、HE染色和透射电镜观察发现,早期股骨头坏死动物模型建立成功;治疗组与模型组相比,股骨头坏死表现明显减轻、细胞凋亡数目明显减少,两组差异有统计学意义(P<0.05)。结论阿魏酸钠可以有效地减轻骨细胞凋亡,延缓或降低股骨头坏死的发生。     

大鼠激活转录因子3单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备特异性识别大鼠激活转录因子3(ATF3)的单克隆抗体(mAb)。方法根据软件预测的结果合成偶联有匙孔绒血蓝蛋白(key holeli mpet hemocyanin,KLH)的大鼠ATF3第168-181位氨基酸多肽。随后免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备抗大鼠ATF3的mAb。采用快速定性试纸法鉴定该单克隆抗体的亚型和亚类;通过ELISA、Western blot和免疫组织化学法鉴定单克隆抗体的特性。结果获得一株可稳定分泌抗大鼠ATF3 mAb的杂交瘤细胞,其分泌的ATF3单抗的亚型是IgG1,轻链为κ链。Western blot结果显示,该单抗能够特异性识别大鼠细胞内表达的ATF3蛋白。免疫组织化学检测结果表明,在Thy-1肾炎(Thy-1N)大鼠肾细胞胞质及细胞核内均有ATF3表达,但细胞核内的表达量较为显著。结论成功制备了一株抗大鼠ATF3的mAb,为进一步研究ATF3的生物学功能提供了可用的实验材料。     

不同生长期晶状体蛋白对体外培养的大鼠视网膜神经节细胞存活的促进作用

目的观察不同生长期大鼠的晶状体蛋白对体外培养的大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)是否具有不同的保护作用。方法分别提取出生后1 d、2周、6月、1年期的SD大鼠晶状体可溶性蛋白,加入培养的RGCs中,观察其对RGCs存活时间、突触生长状况及凋亡的影响。结果同期提取的晶状体蛋白各不同浓度作用于RGCs,促进其存活的作用有差异,最佳有效浓度为10-5g/L。不同生长期大鼠的晶状体蛋白可以延长RGCs存活时间,并随生长期增长而延长,但1 d组与2周组无显著性差异。加入晶状体蛋白后RGCs凋亡减少,随生长期增长而逐级减少。结论晶状体可溶性蛋白可显著促进离体培养的RGCs的存活和生长,晶状体蛋白的最佳有效质量浓度为10-5g/L。不同生长期晶状体蛋白的神经保护作用有所不同,随生长期延长,作用逐渐增强。     

乙型肝炎病毒x蛋白在HBV宫内感染中的作用

目的研究HBV(hepatitis B virus)感染胎盘和正常胎盘在HBxAg(hepatitis B x antigen)蛋白表达上的不同,探讨HBxAg在HBV宫内感染中可能发挥的作用。方法选择24例已证实发生宫内感染的HBsAg(hepatitis Bsurface antigen)阳性孕妇(感染组)和10例正常健康孕妇(对照组)的胎盘组织,应用免疫组织化学SP染色法,检测各组胎盘中HBxAg的表达,用TUNEL法检测细胞凋亡情况。结果在HBV感染组的胎盘中可检测到HBxAg的表达,且高复制组(HBV DNA>1×103拷贝/mL)染色吸光度值明显高于低复制组(HBV DNA<1×103拷贝/mL),差异有统计学意义(P<0.05);HBV感染高复制组细胞凋亡指数低于低复制组和对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 HBxAg/抗细胞凋亡是HBV DNA高复制孕妇发生宫内感染的可能机制,而HBV DNA阴性孕妇存在不同的作用机制。     

非小细胞肺癌患者呼出气冷凝液ET-1测定的意义

目的测定非小细胞肺癌(NSCLC)患者呼出气冷凝液(EBC)中内皮素-1(ET-1)并研究其临床意义。方法按既定标准收集41例NSCLC病例(NSCLC组)及45例正常对照(正常对照组)的EBC并同时抽血分离血清,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定其ET-1含量。结果 NSCLC组EBC和血清的ET-1[(10.35±0.23)pg/mL、(79.62±0.25)pg/mL]显著高于正常对照组[(8.30±0.16)pg/mL、(68.21±0.35)pg/mL],差异有统计学意义(P<0.05);NSCLC腺癌组EBC的ET-1为(11.05±0.31)pg/mL,鳞癌组为(9.61±0.25)pg/mL。随TNM分期,NSCLC组Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期EBC的ET-1分别为(8.61±0.18)、(9.98±0.21)、(11.53±0.36)pg/mL,Ⅱ期与Ⅳ期有统计学差异(P<0.05)。检测EBC中ET-1作为NSCLC诊断方法的敏感性和特异性为95.12%和53.33%。结论测定EBC中ET-1有助于NSCLC的诊断和评估预后。