人羧肽酶A1的毕赤酵母可溶表达

目的应用毕赤酵母表达系统表达人羧肽酶A1(carboxypeptidase A1,CPA1)蛋白。方法从pGEX-CPA1重组质粒中扩增出CPA1基因,亚克隆入酵母表达载体pPIC9K,酵母重组表达载体pPIC9K-CPA1电转化入毕赤酵母SMD1168,并进行营养缺陷筛选和G418抗性筛选,对高拷贝整合的重组酵母表达菌株诱导表达。结果构建得到酵母融合重组表达载体pPIC9K-CPA1,经G418浓度梯度筛选得到串联整合16个重组表达载体的重组酵母表达菌株,诱导表达后得到CPA1蛋白。结论在毕赤酵母中成功表达了CPA1,为进一步研究CPA1在抗体导向酶-前体药物疗法中的应用奠定了基础。     

Retrovirus-mediated transfer of the fusion gene encoding EGFP-BMP2 in mesenchymal stem cells

Bone marrow mesenchymal stemcells(MSCs)are pluripotential stemcells that have the capacitytodifferentiate into chondrocytes and osteoblasts[1].Ithas been well documented that bone morphogeneticproteins(BMPs),a group of proteins belonging tothe TGF-βsuperfamily,can induce bone for mationbothin vivoandin vitroas well as promote osteo-blastic differentiation of MSC[2].HeterologousBMP2is successfully transferred to MSCs and genetherapy is employed based on repairing bony andcartilage defec…     

地塞米松对重症急性胰腺炎胰腺细胞凋亡的影响

目的　探讨地塞米松对大鼠重症急性胰腺炎胰腺细胞凋亡及凋亡调控基因bax蛋白表达的影响。方法　 3 2只SD大鼠以 40g·L-1牛磺胆酸钠诱导建立急性胰腺炎模型 ,随机分为治疗组和非治疗组各 16只 ,对照组 6只。各组术后 6h、12h分别行TUNEL法染色检测胰腺细胞凋亡 ,免疫组化SP法检测胰腺组织中bax蛋白的表达。结果　治疗组大鼠 12h生存率明显高于非治疗组。HE染色显示治疗组胰腺组织炎症较非治疗组明显减轻。TUNEL染色显示治疗组 6h、12h胰腺细胞凋亡指数明显高于非治疗组 (P <0 .0 1)。免疫组化显示bax基因蛋白表达治疗组 6h、12h表达阳性率显著高于非治疗组 (P <0 .0 1) ,正常胰腺组织未见bax基因蛋白表达。结论　地塞米松治疗急性胰腺炎的机制可能与通过诱导胰腺细胞凋亡有关。     

肿瘤基因治疗载体在临床应用中的问题和研究进展

构建安全、有效、可控的载体为肿瘤基因治疗的瓶颈。肿瘤基因治疗载体分为病毒性载体和非病毒性载体。肿瘤基因治疗载体在临床应用中尚存在许多问题,目前的趋势集中于安全性、高效性、靶向特异性和多功能基因联合研究。     

人大肠癌nm23基因与癌组织浸润转移关系的研究

应用免疫组化ABC法，研究43例大肠癌组织中nm23基因产物／NDPK的表达与癌组织浸润转移的关系。结果显示，NDPK在大肠癌原发灶中有较高的表达，阳性率为74．4％，无区域淋巴结转移者阳性率（84．0％）比有区域淋巴结转移者阳性率（61．0％）高，两者比较具有显著性差异（P＜0．05）。原发灶中nm23／NDPK的阳性表达与癌组织浸润深度密切相关，说明nm23／NDPK对肿瘤的浸润转移有重要的抑制作用。还提示，nm23／NDPK的表达不仅与肿瘤的浸润转移有关，还与大肠癌的组织学类型有关。因此，检测大肠癌组织中nm23／NDPK的表达情况，可预测肿瘤的转移和复发。     

肝癌细胞内表达抗肝癌单链抗体对肝癌细胞的杀伤作用

为研究抗肝癌单链抗体（scFV）基因在肝癌细胞内表达对肝癌细胞的作用，采用脂质体转染技术把含抗人肝癌scFV基因的逆转录病毒载体导入人肝癌细胞系HCC9204中。G418筛选阳性细胞克隆。RNAdotblot杂交分析scFV基因在HCC细胞中的表达。光镜及电镜技术观察转染细胞结构的变化。流式细胞仪检测转染细胞的增殖活性。结果：抗人肝癌scFV在人肝癌细胞系HCC9204中稳定有效表达。流式细胞测定出现亚G1期死亡细胞峰；光镜下表现为细胞疏松，胞浆空泡变性，瘤巨细胞增多。电镜分析表现为细胞表面微绒毛显著减少，线粒体及内质网空泡变性，细胞死亡明显。提示：肝癌细胞内表达抗肝癌scFV对肝癌细胞有明显杀伤作用，为肝癌基因治疗提供一种新方法。     

重组小鼠血管抑素基因在胆囊癌细胞中的表达及对血管内皮细胞增殖的抑制作用

目的　研究重组小鼠血管抑素基因真核表达质粒转染的胆囊癌细胞能否表达具有抑制血管内皮细胞生长活性的血管抑素蛋白。方法　应用脂质体LipofectAMINE 2 0 0 0将重组小鼠血管抑素基因的真核表达质粒 pcDNA3.1(+) angiostatin转染胆囊癌细胞株GBC SD ,G4 18抗性筛选 ;以Westernblot检测血管抑素的表达 ,以血管内皮细胞增殖分析检测其活性。结果　经Westernblot检测 ,得到高表达血管抑素的胆囊癌细胞克隆 ,其培养上清能有效抑制bFGF刺激的血管内皮细胞增殖 (P <0 .0 5 )。结论　小鼠血管抑素基因真核表达质粒 pcDNA3.1(+) angiostatin转导的胆囊癌细胞能够表达具有生物学活性的血管抑素蛋白 ,在胆囊癌的血管抑制基因治疗中有潜在临床应用价值     

珞巴族ABO血型系统遗传多态性分析

目的　研究中国珞巴族人群ABO血型系统遗传多态性及与其他 19个族群间的遗传关系。方法　采用玻片法检测并分析了西藏地区珞巴族 12 1人份ABO血型分布 ,应用网络生物信息资源 ,收集西藏昌都、林芝、拉萨、山南、日喀则、那曲藏族 ,青海贵南、黄南、西宁藏族 ,甘肃藏族 ,云南丽江藏族 ,内蒙古蒙古族 ,宁夏回族 ,陕西、河南、山东、福建、广东汉族 ,广西壮族等 19个族群的相应资料 ,计算他们间的遗传距离 ,并进行聚类分析。结果　珞巴族ABO血型系统中 ,有较高的基因频率r(0 .7370 ) ,p为 0 .1911,q为 0 .0 973。遗传距离分析显示 ,珞巴族与南方壮族距离较近(0 .0 5 79) ,其次为云南丽江藏族 (0 .0 6 92 )和西藏林芝藏族 (0 .0 84 4 )及西藏、青海其他地区藏族 ,最后与中国其他主要民族汉、蒙、回族聚在一起 ,聚类分析与遗传距离分析结果基本一致。结论　珞巴族在遗传上与藏族的关系近于其他主要民族     

GFP重组腺相关病毒报告病毒的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组腺相关病毒载体和报告病毒,并观察其在真核细胞的表达。方法采用DNA重组技术将GFP基因片段亚克隆到pss HGCMV载体的EcoRⅠ和BamHⅠ位点,构建表达GFP重组腺相关病毒载体pss HGCMV-GFP。以此载体转染143细胞进行GFP重组腺相关病毒包装,产生重组报告病毒颗粒并作纯化。用地高辛标记的CMV polyA片段作为探针,采用斑点杂交方法检测重组病毒的物理滴度。采用氯化钙法体外转染培养的NI H3T3细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察其在细胞中的表达。结果成功构建了GFP重组腺相关病毒载体和报告病毒—VssCMV-GFP,所获病毒的滴度为3.16×1012病毒颗粒/mL。重组腺相关病毒VssCMV-GFP感染NI H3T3细胞后48h开始出现绿色荧光,并逐渐增强,至120h荧光更加集中且很强。结论VssCMV-GFP对真核细胞具有感染能力,并且GFP可以在活细胞内有效表达,提示该重组腺相关病毒可应用于介导基因转移真核细胞进行基因治疗。     

猴细小病毒Vp2的克隆、表达和鉴定

目的　克隆、表达和鉴定猴细小病毒 (simianparvovirus,SPV)Vp2蛋白。方法　用设计的SPVVp2区的特异性引物 ,PCR法扩增SPVVp2基因DNA片断 ;将获得的基因片断插入 pThioHisA载体中 ,转化大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆 ,利用限制性内切酶酶切和核酸序列分析技术鉴定重组质粒 ;以LB培养液培养转化有插入SPVVp2基因的pThioHisA载体的大肠杆菌 ,以终浓度 1mmol·L -1的IPTG诱导蛋白的表达 ;用SDA PAGE和Westernblot分析和鉴定表达的蛋白。结果　经限制性内切酶酶切和核酸序列分析 ,获得了插入pThioHisA载体框架的SPVVp2基因的表达质粒 ;阳性转化大肠杆菌在IPTG诱导下获得了SPVVp2蛋白的表达 ;SDA PAGE和用抗 Thio及抗 SPVVp2的特异性抗体的Westernblot分析证实了表达蛋白的特异性。结论　获得了SPVVp2基因的表达质粒并在大肠杆菌中得了高效表达 ,为进一步建立SPV感染的检测方法和研究SPV的血清流行病学等奠定了基础。