幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因UreI载体的构建、融合表达及纯化

目的构建幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)尿素通道蛋白基因UreI的融合表达载体,并在E.coliBL21中表达,为进一步研究UreI的功能奠定基础。方法利用分子克隆技术以Hp DNA染色体为模板,扩增Hp UreI基因片段,将目的基因UreI与载体pET32a( )分别经kpnⅠ和HindⅢ双酶切,纯化,连接。筛选阳性重组载体,转化大肠杆菌BL21,以IPTG诱导表达pET32a( )/UreI融合蛋白。表达产物经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,用SDS-PAGE及Western blot分析。结果经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp UreI编码基因,由585 bp组成,与GenBank相应菌株HP AM417 609序列完全一致,无碱基突变。经SDS-PAGE分析显示重组质粒pET32a( )/UreI在原核细胞中得到了高效融合表达,其重组融合蛋白分子量为130 ku,经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上,Western blot分析显示,该重组融合蛋白可被6-His鼠抗单克隆抗体所识别,具有良好的反应原性。结论成功地克隆和构建了原核表达载体pET32a( )/UreI,并在原核细胞中得到了高效融合表达。     

羟基喜树碱对人胆管癌QBC939裸鼠移植瘤PS2、COX-2的影响

目的探讨羟基喜树碱对人胆管癌QBC939裸鼠移植瘤的乳癌相关肽(PS2)、环氧合酶-2(COX-2)的影响,分析PS2、COX-2与肿瘤发生、发展的关系。方法建立人胆管癌QBC939细胞株裸鼠皮下移植瘤模型,将30只裸鼠随机分成对照组、羟基喜树碱低剂量组和羟基喜树碱高剂量组,观察移植瘤体生长情况,RT-PCR法检测瘤体内PS2、COX-2 mRNA表达。结果与对照组比,羟基喜树碱低、高剂量组都可使移植瘤体的PS2 mRNA表达增高;COX-2 mRNA表达降低,且瘤体生长减慢,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论羟基喜树碱可降低移植瘤COX-2 mRNA表达,增高移植瘤体的PS2 mRNA表达,并使人胆管癌裸鼠移植瘤生长减慢。     

NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因重组载体的构建

目的设计构建携带NT4-Ant-Shepherdin[79-87]的cDNA融合基因的重组载体,为针对Survivin的靶向治疗奠定基础。方法应用非对称引物/模板法、PCR技术制备NT4-Ant-Shepherdin[79-87]cDNA片断,连接于pGEM-T-Easy载体,经克隆测序、酶切后与PBV220/NT4质粒连接;转化感受态细胞E.coliDH5α,亚克隆获得NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因。结果克隆出Ant-Shepherdin[79-87]基因,经酶切及测序证实结果正确;连接PBV220/NT4,经克隆、酶切,琼脂糖凝胶电泳证实获得321bp的NT4-Ant-Shepherdin[79-87]目的基因片断。结论通过分子生物学技术成功构建了携带NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因的重组载体,为进一步研究针对Survivin的靶向抗肿瘤作用奠定了基础。     

Study on T lymphocyte subsets and NK cells in patients with Graves＇ disease combined with type 2 diabetes

Objective To investigate changes in T lymphocyte subsets and NK cells in patients with simple Graves' disease (GD)and Graves' disease combined with type 2 diabetes mellitus (GD/T2DM). Methods Fifteen cases of GD/ T2DM were selected from our hospital from November 2001 to November 2004. Before and after therapy thyroid function, thyroglobulin antibody (TGA), thyroid microsomal antibody (TMA) and blood glucose level were measured, and T lymphocyte subsets (CD3, CD4, CD8, CD4/CD8) and NK cells (CD56) were measured by immunofluorescence double labeling monoclonal antibody and flow cytometry, respectively. At the same time, comparison was made with simple GD (15 cases), T2DM (15 cases) and healthy control (20 cases). Results Before therapy, CD4/CD8, CD4 and NK cells in GD/T2DM were less than normal, and there was no significant difference in comparison with simple GD (P<0.05). In T2DM group, only CD4/CD8 and CD4 were less than those of healthy controls (P<0.05). When thyroid function recovered after 1 to 3 months of methimazole treatment in both GD/T2DM and simple GD groups, various indexes recovered, which were more obvious in simple GD. Conclusion Immune hypofunction of GD may be the key to the immune abnormality of GD/T2DM, which is more significant than that of simple GD or T2DM. The recovery of thyroid function and immune abnormality is not consistent, and the recovery of GD is more significant than that of GD/T2DM.     

健胃愈疡颗粒对慢性胃炎伴幽门螺杆菌感染胃黏膜PAF、PS2的表达及对上皮细胞凋亡的影响

目的观察健胃愈疡颗粒(JWYY)对幽门螺杆菌相关性胃炎胃黏膜乳癌相关肽(PS2)和血小板活化因子(plate-let activating factor,PAF)表达的变化,并分析其可能的作用机制。方法80例幽门螺杆菌感染慢性胃炎患者随机分为2组,治疗组42例给予健胃愈疡颗粒治疗,对照组38例给予西药三联药物治疗。应用胃镜下活检胃黏膜组织快速尿素酶和Warthin-Starry染色法检测幽门螺杆菌,应用Western blot检测PS2、PAF表达变化。应用末端转移酶介导的dUTP切口末段标记法(TUNEL)检测细胞凋亡。第4周复查胃镜。结果治疗组凋亡指数明显比对照组减少(P<0.05),治疗组总有效率高于对照组(P<0.05)。Western blot检测显示:JWYY颗粒可上调PS2并下调PAF的表达,而对照组对胃黏膜PS2和PAF的表达影响不大。结论健胃愈疡颗粒治疗幽门螺杆菌(Hp)相关性胃炎可能与杀灭Hp、上调PS2和下调PAF的表达来抑制细胞凋亡有关。     

2型糖尿病患者一级亲属正常糖代谢人群胰岛素抵抗分析

目的探讨2型糖尿病(T2DM)患者糖耐量正常的一级亲属胰岛β细胞功能及胰岛素抵抗情况,并分析胰岛素抵抗的相关因素。方法选取T2DM患者糖耐量正常的一级亲属63例,根据胰岛素抵抗指数分为胰岛素抵抗组及非抵抗组;选取30例健康体检者作为正常对照组。对所选的93例对象进行血压、血糖、胰岛素、血脂的测定,并计算稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)及胰岛β细胞功能指数(HOMA-β)。结果①糖尿病患者一级亲属组与对照组相比,胰岛素水平、HOMA-IR、HOMA-β明显升高(P<0.05);②胰岛素抵抗组体质指数、舒张压、甘油三酯、餐后血糖、HOMA-β明显高于胰岛素非抵抗组(P<0.05);③相关分析示胰岛素抵抗与体质指数、舒张压、甘油三酯、餐后胰岛素呈正相关(P<0.01,P<0.05),与空腹血糖、餐后血糖、空腹胰岛素、收缩压、胆固醇无显著相关性(P>0.05)。结论T2DM患者一级亲属存在胰岛β细胞代偿性的高分泌,早期已经出现胰岛素敏感性的下降和胰岛素抵抗。胰岛素抵抗与体重增加、舒张压升高及甘油三酯的升高有关。提示对糖尿病患者一级亲属应严格控制体重、血压及血脂,对减少T2DM具有积极意义。     

选择性垂体甲状腺激素抵抗综合征患者的临床特点与THRβ基因突变的研究

目的研究2例选择性垂体甲状腺激素抵抗综合征患者的临床特点及甲状腺激素受体β(THRβ)基因突变,探索该病的发病机制。方法收集2例患者及其父母的临床资料并留取外周血标本,提取基因组DNA,应用PCR-DNA直接测序的方法研究患者及父母的THRβ基因有无突变。结果2例患者及父母的THRβ基因第1-10外显子未发现突变。结论散发性垂体甲状腺激素抵抗综合征患者发病可能与THRβ基因突变无关。     

5-羟色胺转运体基因多态性和抑郁症的发病、性别、严重程度及自杀行为的相关性

目的探讨中国汉族人群5-羟色胺转运体启动区(5-HTTLPR)基因多态性和抑郁症的发病、性别、严重程度及自杀是否相关。方法应用聚合酶链式反应(PCR)扩增技术测定150例抑郁症患者和150例正常对照者的5-HT-TLPR基因型和等位基因,分别验证各种基因型与中、重度抑郁症发病、性别及自杀行为的相关性。结果病例组SS、LS基因型及S等位基因频率均高于对照组(26.0% vs.20.0%;52.7% vs.46.0%;52.3% vs.43.0%;P均<0.05);两组性别分层比较,女性S等位基因频率高于对照组(55.3% vs.43.6%,P<0.05);病例组严重程度分层比较差异无统计学意义(P>0.05);病例组有无自杀行为分层比较,有自杀行为患者SS基因型频率(37.3% vs.20.2%)及S等位基因频率(61.8% vs.47.5%)均高于无自杀行为患者(P<0.05);抑郁自杀组性别分层比较未显示显著性差异(P>0.05);抑郁自杀组病情程度分层比较,重度抑郁自杀者SS基因型频率(42.5% vs.18.2%)及S等位基因频率(68.7% vs.36.4%)均高于中度抑郁自杀者(P<0.05)。结论在中国汉族人群中,5-HTTLPR多态性和抑郁症相关。S等位基因可能是抑郁症的易感基因,特别是女性,SS型可能是抑郁症易感基因型;S等位基因可能是抑郁症患者自杀的危险基因,SS基因型人群可能是抑郁症患者自杀的危险人群,特别是携带S等位基因的重度抑郁症患者更易自杀。     

WWOX蛋白在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

目的 探讨WWOX(WW domain-containing oxidoreductase)基因在非小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义.方法 用免疫组化方法检测50例鳞癌、31例腺癌及20例癌旁正常组织中WWOX基因蛋白的表达,并分析其与各临床病理指标之间的相关性.结果 WWOX基因在72.8%的非小细胞肺癌中失表达或表达减少,而在相邻正常肺组织中有80.0%正常表达.WWOX基因的表达与组织类型、细胞分化程度密切相关(P<0.05),在鳞癌和低分化癌中WWOX基因失表达或表达减少.结论 WWOX蛋白在非小细胞肺癌组织中呈低表达,该蛋白表达的缺失可能在不同类型非小细胞肺癌的形成中发挥了不同的作用.     

EGFR、Ku70、NF-κB及Bcl-2在Graves病中的表达及意义

目的研究Graves病患者细针穿刺组织中EGFR、Ku70、NF-κB和Bcl-2基因的表达水平,探讨其在Graves病发生发展中的作用。方法 Graves病组患者59例,平均年龄(44.66+12.94)岁,其中男16例,女43例;甲状腺结节周围正常甲状腺组织标本27例为对照组,平均年龄(44.64+14.27)岁,其中男6例,女21例。采用实时荧光定量逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)法检测EGFR、Ku70、NF-κB和Bcl-2在Graves病及对照组甲状腺组织中的表达,t检验分析基因表达水平差异;Pearson相关法分析基因表达与临床特征及相关血清学指标之间的关系。结果上述基因在对照组及Graves病甲状腺组织中都有不同程度的表达。Graves病患者组织中EGFR及Ku70的表达水平明显高于对照组甲状腺组织(1.752±0.660 vs.0.859±0.125,P<0.05;3.304±0.402 vs.0.768±0.102,P<0.001);NF-κB及Bcl-2的表达水平明显低于对照组甲状腺组织(0.578±0.066 vs.0.884±0.085,P<0.001;0.834±0.086vs.1.235±0.261,P<0.05)。Graves病组织中NF-κB与Bcl-2表达水平呈正相关(r=0.399,P<0.001)。Graves病组织中Ku70的表达水平与血清TgAb水平呈正相关(r=0.263,P<0.05),而其他基因表达与相关血清学指标无关(P均>0.05)。结论 Ku70、EGFR、NF-κB、Bcl-2介导的信号转导通路可能参与了Graves病的发生、发展过程。