人神经生长因子成熟蛋白基因片段在大肠杆菌中的表达和生物活性鉴定

目的　在大肠杆菌中表达人神经生长因子成熟蛋白基因片段(hNGFβ)并检测其生物活性。方法　将 NGFβ目的基因亚克隆入表达载体pBV220的BamHI- BamHI位点,连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株通过热诱导表达NGFβ蛋白,利用溶解包涵体和重折叠使表达产物复性,将复性后的蛋白质加入体外培养的鸡胚背根神经节及 PC12 细胞BrdU掺入实验,观察表达蛋白的生物学活性。结果　成功构建了重组质粒 pBV220/NGFβ。使用该质粒转化 DH5α宿主菌,使用热诱导方法表达了NGFβ蛋白,SDS PAGE结果提示表达蛋白主要存在于包涵体中。通过肝素亲和层析可以获得纯度大于90%的 NGFβ。每升表达菌可以获得 1.8~2.0 mg NGFβ。鸡胚背根神经节突起生长实验和PC12细胞培养生长刺激BrdU掺入实验表明原核表达的 NGFβ是具有生物活性的。它的生物活性按生物制品鉴定章程判断为1×105 BU/g。结论　在大肠杆菌中可以表达出有活性的NGFβ蛋白。     

人MCHR1真核表达载体构建及稳定转染HEK293细胞系的建立

目的构建人MCHR1真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染的HEK293细胞系。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HEK293细胞系,用RT-PCR、Western-blot检测MCHR1的表达。结果构建了pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体,建立了稳定转染的HEK293细胞系,并成功地表达了目的基因。结论真核表达载体成功构建和稳定转染HEK293细胞系的建立为进一步研究MCHR1的功能奠定了良好的实验基础。     

人杀菌渗透增强性蛋白N末端片段在大肠杆菌中的表达

目的构建表达人杀菌渗透增强性蛋白(BPI)N-端193个氨基酸的重组表达质粒,诱导表达BPI193重组蛋白。方法应用RT-PCR的方法从HL-60细胞内扩增出BPI氨基端1-193个氨基酸的基因序列,克隆入T载体。将BPI193基因片段定向克隆入原核表达载体PET-28a中,构建重组的原核表达质粒PET-BPI193,转化大肠杆菌BL21菌株,用IPTG诱导表达蛋白。应用SDS-PAGE检测蛋白表达情况,计算机薄层扫描分析蛋白占菌体总蛋白百分比;Western-blot技术检测表达蛋白的特异性。结果从HL-60细胞中扩增得到579bp的BPI193基因片段,构建了T-BPI193亚克隆和PET-BPI193重组表达质粒。转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导,经SDS-PAGE检测表明,成功表达了6His-BPI193融合蛋白。计算机薄层扫描分析表达量占菌体总蛋白的12%。Western-blot检测显示表达产物具有特异性。结论成功构建了PET-BPI193重组表达质粒。在大肠杆菌BL21内,诱导获得了BPI193与组氨酸融合表达的重组蛋白。     

互通式立交匝道运行速度计算

以某互通立交匝道为例,用“模型法”计算了小客车在各条匝道上不同路段的运行速度：用运行速度理论进行了匝道运行速度协调性和一致性的评价,检验了匝道线形指标,并提出相应的优化措施。     

蛋白印迹法与免疫荧光法检测白血病患者Survivin表达

目的　比较蛋白印迹法和免疫荧光法检测Survivin表达结果,以探寻临床上切实可行的检测方法。方法　应用蛋白印迹(Western blots)和免疫荧光法检测18例白血病患者和10例正常对照组外周血中单个核细胞Survivin的表达。结果　Western blots 法检测Survivin 表达阳性13 例(72. 2%);免疫荧光法检测Survivin 表达阳性11 例(61.1%)。两种方法检测10例正常对照组外周血单个核细胞中Survivin的表达均为阴性。两种检测方法的符合率为88.89%。结论　Survivin是否表达可能成为白血病临床诊断、预后判断的有效指标。两种检测方法具有良好的一致性,免疫荧光法操作比较简单,适于在临床上应用。     

人颗粒酶B融合蛋白基因的诱导表达导致HeLa细胞凋亡

目的　观察诱导表达的颗粒酶B融合蛋白对HeLa细胞形态和生长的作用。方法　用重组PCR法将活性型颗粒酶B基因序列的 5’端连接绿脓杆菌外毒素 (PE)的部分转位肽编码序列。所获融合蛋白基因克隆入pIND诱导表达载体后 ,与辅助质粒pVgRXR共转染HeLa细胞 ,经G4 18和zeocin筛选建系。间接免疫荧光检测蜕皮激素诱导后目的蛋白的表达 ,并通过电镜、TUNEL染色、细胞计数等方法观察细胞的形态和生长速度的变化。结果　建立了可诱导表达人颗粒酶B融合蛋白基因的HeLa细胞系。蜕皮激素诱导后检测到目的蛋白的表达 ,同时观察到细胞出现多核巨细胞的异常形态 ,细胞生长受到抑制。电镜和TUNEL分析表明 ,颗粒酶B融合蛋白基因的诱导表达使部分细胞呈现凋亡的典型特征。结论　颗粒酶B融合蛋白基因的诱导表达导致HeLa细胞凋亡     

论新形势下利益表达的法律保护

随着我国政治、经济、文化的发展,我国人民的利益表达出现了一系列新情况,与此同时,制约利益表达的因素依旧存在．对法律与利益的关系进行理论与实践的分析后,认为在新形势下,我们应该充分发挥法律对利益表达的保护作用,使我国人民的利益表达更加顺畅,为我国的民主制度建设与法制建设提供理论支撑．     

抗微管类、铂类药物对人淋巴瘤细胞系体外敏感性实验及TUBB3、ERCC1表达的相关性分析

目的探讨4种淋巴瘤细胞系(SNK-6、HUT-78、DoHH2、YTS)对8种抗微管类、铂类药物的敏感性与3型β-微管蛋白基因(TUBB3)、切除修复交叉互补基因1(ERCC1)表达水平的关系,为淋巴瘤个体化治疗的靶标检测提供理论依据。方法采用CCK-8实验检测4种细胞系对多西他赛(TXT)、长春瑞滨(NVB)、长春新碱(VCR)、紫杉醇(TAX)以及洛铂(LB)、顺铂(DDP)、奥沙利铂(OXA)、卡铂(CBP)的体外敏感性;采用半定量PCR(RT-PCR)及实时荧光定量PCR(RQ-PCR)检测TUBB3、ERCC1基础表达水平以及长春新碱、卡铂作用后mRNA的表达水平。结果不同细胞系TUBB3、ERCC1基础表达水平存在较大变异。相关性分析表明,4种细胞系对长春新碱的敏感性与TUBB3表达呈正相关(r=0.598,P=0.039),对卡铂的敏感性与ERCC1表达呈负相关(r=-0.789,P=0.002),对其余药物的敏感性与所检基因表达水平无关(P>0.05)。经长春新碱作用后TUBB3表达显著下调(P<0.05),经卡铂作用后ERCC1表达无明显变化(P>0.05)。结论 TUBB3高水平表达的细胞系对长春新碱相对敏感;ERCC1低水平表达的细胞系对卡铂相对敏感。TUBB3、ERCC1的表达可能与淋巴瘤的疗效相关而应用于淋巴瘤个体化治疗的靶标检测。     

人IL-18cDNA克隆及原核表达

目的　从外周血单核细胞中克隆人IL 1 8成熟编码序列cDNA ,对其进行测序并构建原核表达载体 ,进行原核表达。方法　从人外周血单核细胞中分离总RNA ,进行RT PCR获得人IL 1 8cDNA。测序证实其结果正确后 ,构建原核表达载体。E .coli的表达产物通过SDS PAGE、WesternBlot证实。结果　所克隆的人IL 1 8cDNA编码序列经测序证实与GenBank所报道的序列完全一致 ,细菌表达产物经SDS PAGE证实其大小约为 1 8.3KDa,WesternBlot进一步证实了所表达产物的正确性。结论　本研究结果为进一步探讨IL 1 8的生物学活性和特性奠定了基础 ,同时亦为利用人IL 1 8进行免疫基因治疗的研究打下了良好的基础。     

ADENO-ASSOCIATED VIRUS INTRODUCED INTEGRATION AND EXPRESSION OF FOREIGN GENES IN PC12 CELLS

The ability to induce the expression of targetgenes in neurons is a goal of molecular neurobiolo-gy up to now. A variety of means including lipo-somes and recombinant retrovirus vectors and re-combinant adenovirus vectors have been used to ac-coplish this goal. Each method has some specificdisadvantages['J. None can provide reliable andcontinuouk gene expression in neurons of the cen-tral nervous system.Vectors derived from adeno--associaed virus(AAV ) have the potential to stably transducem…