人白介素24cDNA克隆、突变纠正和原核表达

目的获取人白介素24(IL-24)cDNA,构建原核表达载体以表达含有谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白GST-IL-24。方法以人外周血单核细胞(PBMC)总RNA为模板,RT-PCR扩增IL-24 cDNA,克隆入原核表达载体pGEX-4T-2,测序结果显示在IL-24 cDNA第223位G→A,370位T→C,从而导致其编码蛋白的氨基酸发生改变:A75T,H124Y,通过二次PCR将其纠正,重组载体pGEX-IL-24转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基--βD-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE,Western blot检测显示有融合蛋白GST-IL-24表达。结果通过RT-PCR及二次PCR得到人IL-24 cDNA,构建其原核表达载体,经IPTG诱导在相对分子量约为50 000处有融合蛋白表达。结论IL-24的重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)可以表达GST-IL-24融合蛋白。     

EXPRESSION OF PRE S ROTEIN OF HBV AS A ALKALINE PHOSPHATASE FUSION PROTEINS IN NIH 3T3 CELLS

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基因芯片技术在COX10等无精症患者相关基因的分析

目的　运用基因芯片技术获取正常生育者睾丸组织与无精症患者睾丸组织中差异表达的基因 ,并对结果进行生物信息学分析。方法　分别抽提正常生育者与无精症患者睾丸组织中mRNA制备探针 ,应用基因芯片技术观察二者表达谱差异情况 ,并对其中明显下调的COX10基因进行生物信息学分析。结果　通过人基因芯片筛选 ,获得 12 0条与无精症相关的基因 ,其中明显下调的基因COX10与人类精子调控关系密切。结论　基因芯片筛选正常生育者与无精症患者睾丸组织差异表达基因具有样品用量少 ,高敏感性 ,快速高效等特性 ,可用于筛选和研究无精症相关基因     

人羧肽酶A1的毕赤酵母可溶表达

目的应用毕赤酵母表达系统表达人羧肽酶A1(carboxypeptidase A1,CPA1)蛋白。方法从pGEX-CPA1重组质粒中扩增出CPA1基因,亚克隆入酵母表达载体pPIC9K,酵母重组表达载体pPIC9K-CPA1电转化入毕赤酵母SMD1168,并进行营养缺陷筛选和G418抗性筛选,对高拷贝整合的重组酵母表达菌株诱导表达。结果构建得到酵母融合重组表达载体pPIC9K-CPA1,经G418浓度梯度筛选得到串联整合16个重组表达载体的重组酵母表达菌株,诱导表达后得到CPA1蛋白。结论在毕赤酵母中成功表达了CPA1,为进一步研究CPA1在抗体导向酶-前体药物疗法中的应用奠定了基础。     

人大肠癌nm23基因与癌组织浸润转移关系的研究

应用免疫组化ABC法，研究43例大肠癌组织中nm23基因产物／NDPK的表达与癌组织浸润转移的关系。结果显示，NDPK在大肠癌原发灶中有较高的表达，阳性率为74．4％，无区域淋巴结转移者阳性率（84．0％）比有区域淋巴结转移者阳性率（61．0％）高，两者比较具有显著性差异（P＜0．05）。原发灶中nm23／NDPK的阳性表达与癌组织浸润深度密切相关，说明nm23／NDPK对肿瘤的浸润转移有重要的抑制作用。还提示，nm23／NDPK的表达不仅与肿瘤的浸润转移有关，还与大肠癌的组织学类型有关。因此，检测大肠癌组织中nm23／NDPK的表达情况，可预测肿瘤的转移和复发。     

CLONING SEGMENT SPIKE PROTEIN GENE OF SARS-COV AND ITSEXPRESSION IN ESCHERICHIA COLI

Objective Expressing and purifying the seglnent of SARS-CoV spike protein in E. Coli Methods The target gene was obtained by RT-PCR. The PCR product was cloned into pEGM- T Easy Vector, sequencing and double restriction digestion (BamH Ⅰ , Pst Ⅰ) were performed. The target gene was subcloned into PQE30 expression vector. The gene was expressed in the E. coli strain M15 cells induced by IPTG. The protein was purified with a nickel HiTrap chelating metal affinity column. Results The recombinant expression plasmid was successfully constructed and the protein was well expressed in E. coli strain M15 cells. The ideal pure protein was obtained by purification. Western blotting analysis suggested the protein could act with the convalescent sera of lab confirmed SARS patients. Conclusion The segment of SARS-CoV spike protein was well expressed and purified, and can be applied in diagnosis and immunological research of SARS.     

GFP重组腺相关病毒报告病毒的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组腺相关病毒载体和报告病毒,并观察其在真核细胞的表达。方法采用DNA重组技术将GFP基因片段亚克隆到pss HGCMV载体的EcoRⅠ和BamHⅠ位点,构建表达GFP重组腺相关病毒载体pss HGCMV-GFP。以此载体转染143细胞进行GFP重组腺相关病毒包装,产生重组报告病毒颗粒并作纯化。用地高辛标记的CMV polyA片段作为探针,采用斑点杂交方法检测重组病毒的物理滴度。采用氯化钙法体外转染培养的NI H3T3细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察其在细胞中的表达。结果成功构建了GFP重组腺相关病毒载体和报告病毒—VssCMV-GFP,所获病毒的滴度为3.16×1012病毒颗粒/mL。重组腺相关病毒VssCMV-GFP感染NI H3T3细胞后48h开始出现绿色荧光,并逐渐增强,至120h荧光更加集中且很强。结论VssCMV-GFP对真核细胞具有感染能力,并且GFP可以在活细胞内有效表达,提示该重组腺相关病毒可应用于介导基因转移真核细胞进行基因治疗。     

猴细小病毒Vp2的克隆、表达和鉴定

目的　克隆、表达和鉴定猴细小病毒 (simianparvovirus,SPV)Vp2蛋白。方法　用设计的SPVVp2区的特异性引物 ,PCR法扩增SPVVp2基因DNA片断 ;将获得的基因片断插入 pThioHisA载体中 ,转化大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆 ,利用限制性内切酶酶切和核酸序列分析技术鉴定重组质粒 ;以LB培养液培养转化有插入SPVVp2基因的pThioHisA载体的大肠杆菌 ,以终浓度 1mmol·L -1的IPTG诱导蛋白的表达 ;用SDA PAGE和Westernblot分析和鉴定表达的蛋白。结果　经限制性内切酶酶切和核酸序列分析 ,获得了插入pThioHisA载体框架的SPVVp2基因的表达质粒 ;阳性转化大肠杆菌在IPTG诱导下获得了SPVVp2蛋白的表达 ;SDA PAGE和用抗 Thio及抗 SPVVp2的特异性抗体的Westernblot分析证实了表达蛋白的特异性。结论　获得了SPVVp2基因的表达质粒并在大肠杆菌中得了高效表达 ,为进一步建立SPV感染的检测方法和研究SPV的血清流行病学等奠定了基础。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因表达对人肝癌细胞的生长抑制

使用转导有单纯疱疹Ⅰ型病毒胸苷激酶（ＨＳＶ１－ＴＫ）基因的人肝癌ＳＭＭＣ－７７２１细胞株建立了裸鼠移植瘤模型，并进行了在体和体外试验性无环鸟苷（ＡＣＶ）治疗。结果发现基因转导后的肝癌细胞表现出对ＡＣＶ的敏感性，肝癌细胞生长抑制与ＡＣＶ的剂量有关；用药组裸鼠除平均瘤重明显低于对照组外，还可见细胞核分裂指数降低，伴有细胞变性和坏死。结果表明：ＨＳＶ１－ＴＫ基因经逆转录病毒转导后，用ＡＣＶ诱导表达明显抑制了人肝癌细胞的生长。     

逆转录病毒转移的β－半乳糖苷酶基因在成纤维细胞中的表达

为了研究逆转录病毒载体转移外源基因的实用性，我们采用小鼠白血病病毒（ＭｏＭＬＶ）载体将大肠杆菌的β－半乳糖苷酶基因（ｌａｃＺ）和抗新霉素（ＮｅｏＲ）基因转移到大鼠成纤维细胞内，对整合后的前病毒结构和基因表达进行了酶活性测定和ＤＮＡ分析。结果表明：ｌａｃＺ基因可以在大鼠皮肤成纤维细胞和２０８Ｆ细胞株中较长时间地表达；前病毒整合位点、靶细胞特性和整合后的载体结构与转入基因表达的稳定性紧密相关。