酵母双杂交系统筛选HBV PreS1相互作用蛋白

目的利用Sos招募系统(SRS),构建含HBV PreS1基因的酵母双杂交诱饵载体,筛选人肝细胞与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,进一步探讨HBV侵入肝细胞的机制。方法以HBV ayw亚型全长质粒PCP10为模板,PCR扩增HBV PreS1基因,克隆到酵母表达载体pSos中,构建诱饵质粒pSos-PreS1,将其转化cdc25酵母感受态细胞,提取酵母蛋白质进行Western blot分析,证实其在酵母细胞中的表达;将pSos-PreS1分别与pMyr Lamin C、pMyr SB共转化酵母,证实诱饵蛋白无自激活作用。将pSos-PreS1与人肝cDNA文库共转化cdc25酵母感受态细胞,通过营养及温度选择性培养筛选阳性菌落,扩增阳性菌落目的基因并测序。结果成功构建了HBV PreS1基因酵母双杂交诱饵载体pSos-PreS1,筛选得到5个准阳性克隆,序列分析表明其分别与人类钾通道调制因子1(KCMF1)、细胞色素C、VitD结合蛋白、人源去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)和人白蛋白具有高度同源性。结论利用SRS筛选出5个可能与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,为进一步了解HBV侵入肝细胞的机制奠定了基础。     

阻断5-HT1B受体对正常和帕金森病大鼠底丘脑核神经元活动的不同作用

目的观察体循环给予5-HT1B受体拮抗剂SB224289后,对正常大鼠和帕金森病(Parkinsons disease,PD)模型大鼠底丘脑核(subthalamic nucleus,STN)神经元电活动的影响。方法采用在体细胞外记录的方法,研究正常和PD大鼠STN神经元电活动的变化;比较阻断5-HT1B受体后两组大鼠STN神经元电活动的改变。结果①PD组大鼠STN神经元的平均放电频率[(7.87±1.37)Hz]明显高于正常组大鼠[(6.59±1.44)Hz,P<0.001]。两组大鼠STN神经元均表现为规则、不规则和暴发式放电3种形式。正常组大鼠具有规则、不规则和暴发式放电的神经元比例分别为33.33%、54.17%和12.50%;PD组分别为31.25%、35.42%和33.33%,PD组大鼠具有暴发式放电的神经元的百分比显著高于正常组(P<0.01)。②阻断5-HT1B受体后,正常大鼠STN神经元平均放电频率明显增高(P<0.01),具有暴发式放电的神经元数量显著增多(P<0.05)。而PD组大鼠阻断5-HT1B受体后STN神经元的放电频率和放电形式均无明显变化。结论 PD大鼠STN神经元呈过度兴奋状态;阻断5-HT1B受体可兴奋正常大鼠的STN神经元,而不影响PD大鼠的神经元活动。     

Ⅰ型胶原蛋白基因在反流性食管炎、Barrett食管及食管腺癌中的表达

目的探讨反流性食管炎、Barrett食管及食管腺癌黏膜组织中Ⅰ型胶原蛋白(COL1A1)基因mRNA的表达水平及意义。方法经胃镜取材,采用荧光定量PCR方法检测反流性食管炎、Barrett食管、食管腺癌组织中COL1A1基因mRNA的表达水平。结果 COL1A1mRNA在正常组和反流性食管炎阴性组食管黏膜中呈低表达(0.154±0.119,0.152±0.105),在Barrett食管与食管腺癌食管黏膜中呈明显的高表达(0.396±0.170,0.726±0.561)。并且在从正常→反流性食管炎→Barrett食管→食管腺癌的发生、发展过程中,COL1A1mRNA的表达呈现渐进性增强,并与病期有关。结论 COL1A1基因的异常表达与反流性食管炎、Barrett食管和食管腺癌的发生、发展密切相关;COL1A1mRNA的表达水平可用作监测Barrett食管和食管腺癌早期发生及干预治疗效果的有用指标。     

钙依赖途径在高糖致心肌细胞肥大中的作用

目的探讨体外培养条件下钙调神经磷酸酶(CN)和钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)是否参与高糖诱导的心肌细胞的肥大反应。方法新生SD大鼠心肌细胞在含150mL/L的新生牛血清培养48h后,换用无血清培养基培养24h,然后用正常糖(5.5mmol/L的D-葡萄糖)、高糖(25mmol/L的D-葡萄糖)和等渗糖(5.5mmol/L的D-葡萄糖+19.5mmol/L的L-葡萄糖)分别培养48h。检测心肌细胞肥大指标:表面积和蛋白含量;用钙成像技术研究其钙瞬变特点;以及利用CN和CaMKⅡ的阻断剂CsA和KN93验证两种酶在肥大过程中的作用。结果与正常糖组和等渗对照组相比,高糖可以诱导心肌细胞肥大和钙超载,增加了心肌细胞的表面积和蛋白含量。CsA和(或)KN93可明显抑制心肌细胞的肥大。结论 CN和CaMKII在高糖诱导的心肌细胞肥大过程中发挥重要的作用。     

介导p73去阻抑肽表达的重组腺伴病毒的构建和鉴定

目的构建编码融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT的重组腺伴病毒表达载体,为恶性肿瘤基因治疗的实验研究奠定基础。方法采用互补引物二次PCR法以及T载体克隆法获得p53(N37)基因克隆,酶切后将其连同穿膜肽HA2-TAT片段一起连入pUC19/NT4质粒,再将融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT亚克隆至腺伴病毒的穿梭质粒pSSHG-CMV中,构建重组质粒pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并进行酶切鉴定;应用磷酸钙沉淀法,pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT、辅助质粒pAAV-Ad,腺病毒全基因组质粒pFG140三种质粒共转染HEK293细胞,包装出重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并用斑点杂交法测定重组病毒的滴度;MTT比色法、流式细胞仪观察重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT对HepG2细胞的抑制作用。结果克隆出p53(N37)基因,经酶切及测序证实结果正确;得到高滴度的(2×1013pfu/L)重组腺伴病毒表达载体并对HepG2细胞有明显的抑制作用,且这一作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT复制缺陷型重组腺伴病毒,为下一步开展在p53突变或缺失肿瘤中针对p73的靶向性肿瘤基因治疗研究奠定了基础。     

MDR1、BCRP和LRP基因在乳腺癌组织中的表达及其意义

目的探讨多药耐药基因(MDR1)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)及肺耐药蛋白(LRP)mRNA在乳腺癌组织中的表达及其相互关系,分析它们与乳腺癌临床病理特征的关系。方法采用RT-PCR方法检测2007年1月至2007年12月在宁夏医科大学附属医院手术切除的42例乳腺癌组织、42例癌旁组织及50例乳腺良性病变中MDR1、BCRP和LRP mRNA的表达。结果乳腺癌组织中MDR1、BCRP、LRP mRNA的阳性表达率分别为40.47%、38.09%及61.90%,与癌旁组织及乳腺良性病变组织相比阳性表达率均有统计学差异(P<0.05)。MDR1mRNA表达与绝经状况呈完全正相关(r=0.398,P<0.01),与腋窝淋巴结状况呈完全正相关(r=0.398,P<0.01);BCRP mRNA表达与腋窝淋巴结状况呈正相关(r=0.355,P<0.05);LRP mRNA表达与绝经状况、年龄、腋窝淋巴结状况及肿瘤大小之间均无相关性(P>0.05);MDR1mRNA和BCRP mRNA表达呈正相关(r=0.652,P<0.01),LRP mRNA与MDR1mRNA表达无相关性(r=0.147,P>0.05);LRP mRNA和BCRP mRNA表达无相关性(r=0.111,P>0.05)。2个耐药基因共表达率为47.61%,2种或3种耐药基因共表达率为61.89%。结论乳腺癌组织中存在耐药基因MDR1、BCRP和LRP的表达,单基因和多基因协同作用,以多基因共表达为主;检测MDR1和BCRP基因表达水平可辅助临床判断乳腺癌患者的预后。     

正常人及肠易激综合征患者肠黏膜孤啡肽受体的表达

目的检测正常人及肠易激综合征(IBS)患者肠黏膜孤啡肽受体(ORL-1)的表达,探讨其在IBS患者发病机制中的作用。方法黏膜标本取自20例正常人和27例腹泻型(D-IBS)、23例便秘型(C-IBS)患者空肠上段及升结肠,应用实时荧光定量RT-PCR法对肠黏膜ORL-1的表达进行定量分析。结果正常对照组空肠上段及升结肠均有ORL-1mRNA的表达,且空肠上段表达量高于升结肠(P<0.05);D-IBS患者空肠及升结肠黏膜ORL-1mRNA表达量均低于正常对照组(P<0.05),C-IBS患者与正常对照组间无差异。结论 ORL-1受体在人胃肠运动及IBS的病理生理机制中可能具有重要作用;OFQ/ORL-1系统对IBS不同亚型的调节具有异质性。     

胰岛素抵抗指数及高敏C-反应蛋白对急性冠脉综合征冠脉病变的预测价值

目的探讨胰岛素抵抗指数(insulin resistance index,IRI)及血清高敏C-反应蛋白(hsCRP)在急性冠脉综合征(ACS)病情及预后方面的预测价值。方法选择ACS患者171例及32例正常健康人作为对照组,分别测定各组身高、体重、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLc)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLc)水平、空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(Fins)水平及冠脉狭窄程度,计算体重指数(BMI)、稳态模型评估法(HOMA)评估IRI(HOMA-IR)、冠脉阻塞积分(CAOS)并进行对比分析。结果 ACS患者TC、LDLc、FPG、Fins、HOMA-IR、hsCRP、CAOS积分均显著高于正常对照组,HDLc水平明显低于对照组(P<0.05)。结论 ACS患者存在明显胰岛素抵抗;IRI及hsCRP水平对不同病情ACS具有较高的预测价值;IRI及hsCRP水平在ACS病情的诊疗及预后的判断中可以作为一个很好的预测指标。     

超声观测高同型半胱氨酸血症兔内皮功能损伤与血管细胞粘附分子的关系

目的研究高同型半胱氨酸血症(HHcy)兔血浆细胞粘附分子-1(VCAM-1)及一氧化氮(NO)的变化与内皮依赖性舒张功能(EDD)的关系,探讨内皮功能损伤的机理。方法将22只新西兰兔随机分为两组,每组11只,分别喂食正常饲料(正常对照组)、L-蛋氨酸[0.8g/(kg.d)]饲料(蛋氨酸组),分别于0、20、40、60、80d取血检测NO和VCAM-1的浓度,同时应用高分辨力超声检测其髂外动脉EDD的改变。结果①与正常对照组相比,蛋氨酸组兔髂外动脉的EDD显著降低,且呈明显的时间依赖性[80d,(-1.74±3.58)%vs.0d,(13.43±4.13)%,P<0.01];②与正常对照组相比,蛋氨酸组兔血浆中NO明显降低[80d,(217.43±27.38)μmol/L vs.0d,(379.75±56.83)μmol/L,P<0.05],血浆VCAM-1却明显升高[80d,(0.091 2±0.009 7)ng/mLvs.0d,(0.047 2±0.004 7)ng/mL,P<0.01],亦呈现明显的时间依赖性。结论高分辨力超声检测到的内皮依赖性舒张功能降低与血浆粘附分子明显相关,同型半胱氨酸(Hcy)导致内皮功能损伤是一个多途径的综合损伤。     

浅谈“2+1”订单人才培养模式下高职院校团学活动开展中的问题与对策

"2+1"订单人才培养模式是我国近年来职业技术教育中一种新的人才培养模式,它为高职教育发展指明了正确方向,是高职院校适应经济社会发展的必然选择和重要体现。然而这种模式的实施对品牌校园团学活动的沉淀和推广造成一定的困难。文中结合笔者所在高职院校的"2+1"订单人才培养模式,分析了在此模式下高职院校团学活动开展存在的问题,并提出相应对策。