反义HSP70真核表达载体的构建和在人喉癌细胞的表达

目的　进行促凋亡治疗喉癌实验 ,构建和鉴定携带反义HSP70 (heatshockprotein 70 )基因的真核表达载体。方法　将HSP70cDNA反向克隆入 pcDNA 3.1,构建CMV启动子控制的真核表达载体 pcDNA AHSP70 ,用酶切鉴定结果 ;应用该载体转染人喉表皮样癌细胞Hep 2 ,G4 18筛选阳性克隆 ;westernblot和免疫组化检测转染前后瘤细胞的HSP70的表达。检测转染前后瘤细胞的生物学性状。结果　获得 pcDNA AHSP70真核表达载体 ,HSP70反义RNA阻断了Hep 2细胞的HSP70的表达 ,经westernblotting和免疫组化证实 ,实验组瘤细胞不能表达或低表达HSP70 ,而对照和空载体组高表达HSP70。转染反义HSP70的真核表达载体的Hep 2细胞比空载体组和对照组的细胞生长缓慢 ,细胞周期可见实验组出现亚二倍凋亡峰 ,而空载体组没有。结论　本研究成功构建了反义HSP70真核表达载体并在人喉癌细胞得以表达。     

腺病毒携带GFP在豚鼠耳蜗基因转导的形态结构与功能改变

目的　带有绿色荧光蛋白 (GFP)基因的腺病毒注入豚鼠耳蜗后 ,观察不同时间段GFP基因的表达和分布情况及手术操作对听力的影响 ,为内耳基因治疗提供理论依据。方法　 1 5只杂色豚鼠术前及术后行听性脑干反应 (ABR)和畸变耳声发射 (DPOAE)检查 ,空白对照组经圆窗或底回钻孔注入人工外淋巴液。实验组注入带有GFP基因的腺病毒。分别于 3、5、7和 1 0d后取材 ,耳蜗标本经硝酸银染色后铺片。结果　腺病毒注入耳蜗后对听阈影响不大。术前术后的DP值有差异。荧光显微镜下可见 3d组表达产物最高。 7d后逐渐减弱 ,1 0d后更弱 ,表达产物主要分布于支持细胞、螺旋神经节细胞和基底膜下的间皮细胞。对照组均无绿色荧光。结论　通过圆窗或底回注入腺病毒对听阈没有影响。单一位点的接种就能使神经营养因子通过耳蜗液扩散到整个耳蜗。有效的基因转移在耳蜗是可行的 ,但表达相对短暂。