肺组织灌注前后双向电泳的比较

目的寻找更加有效的双向电泳方法以展示肺组织蛋白。方法取6只Wistar大鼠随机分为对照组和灌注组,用丙酮/三氯醋酸法提取肺组织蛋白并进行双向电泳分离,将2-D胶银染后用ImageScanner扫描仪扫描,采用ImageMaster 2-D Elite 3.10软件进行图象分析。结果对照组2-D胶的蛋白点计数为1 095±5,灌注组蛋白点计数为1 569±10。在分子质量30-70 ku范围内,灌注组的蛋白点计数显著高于对照组(P<0.01),在其他分子质量范围内二者蛋白点计数无显著性差异。在pH值5-8、9-10范围内,灌注组的蛋白点计数显著高于对照组(P<0.01),在其他pH值范围内二者蛋白点计数无显著性差异。结论生理盐水灌注法可显著减少肺组织中的血液蛋白成分,使得肺组织蛋白可以更好的在2-D胶上展示。     

人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞7702的差异蛋白质组学研究

目的应用蛋白质组学技术探讨人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞7702的蛋白质差异表达谱,筛选肝细胞癌的特异性标志物。方法应用双向电泳(2-DE)方法对细胞总蛋白进行分离和分析,用质谱(MS)鉴定差异表达蛋白,并用免疫组化方法验证部分差异表达蛋白。结果与7702细胞相比,在HepG2细胞中鉴定出17种差异表达蛋白,10种上调,7种下调,主要涉及物质代谢酶和抗凋亡、调节应激和细胞间信号传导的蛋白质;免疫组化结果验证了膜联蛋白A1(annexin A1)和亲环蛋白A(cyclophilin A)在肝细胞癌病理组织中均明显上调,且主要定位于胞质内。结论人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞7702的蛋白质表达差异显著,其中膜联蛋白A1和亲环蛋白A可作为肝细胞癌诊断及治疗的分子标志物。     

适用于细粒棘球蚴囊液蛋白质组分析的双向电泳技术

目的建立适用于细粒棘球蚴囊液蛋白质组的双向电泳分离条件。方法冷冻干燥法制备囊液总蛋白提取物,观察不同的蛋白样品处理方法、IPG胶条pH范围和电泳上样量对双向电泳图谱的影响。结果经ReadyPrepTM2-D Cleanup Kit处理的提取物上样量为400μg,在pH7~10范围的胶条进行双向电泳分离,可获取蛋白斑点较多、重复性较好的二维电泳图谱。结论建立的细粒棘球蚴囊液双向电泳技术及图谱,可为细粒棘球蚴虫蛋白质组学的研究提供理论依据。     

表皮葡萄球菌双组分信号转导系统saeRS对相关蛋白调控的研究

目的利用双向电泳技术对表皮葡萄球菌菌体蛋白进行蛋白质组学分析,寻找双组分信号转导系统saeRS的调控网络。方法对表皮葡萄球菌1457双组分信号转导系统saeRS删除株与野生株菌体蛋白进行双向电泳差异比较;电泳图谱采用Image Master 2DPlatinum软件分析;免疫印迹法验证saeRS调控的差异蛋白。结果在表皮葡萄球菌1457双组分信号转导系统saeRS删除株与野生株蛋白质图谱中共发现23个差异表达的蛋白点(10个下调,13个上调)。结论蛋白质双向电泳技术可以成功应用于分析表皮葡萄球菌双组分信号转导系统saeRS的调控网络;此图谱为进一步研究saeRS在表皮葡萄球菌中的调控机制奠定了基础。     

家蚕马氏管免疫相关蛋白基因BmNOS的研究

借助蛋白双向电泳(2-D)技术对感染家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)不同时相的家蚕幼虫马氏管蛋白进行分离,并对其中14个差异蛋白点进行质谱分析.结果表明:10个蛋白点得到成功鉴定,其中的一个可信结果为家蚕一氧化氮合酶(Bombyx mori Nitric...     

人肺腺癌细胞系A549细胞双向电泳-飞行时间质谱研究

目的初步分析人肺腺癌细胞系A549细胞蛋白质表达情况,从蛋白组水平探讨肺腺癌发病的分子机制。方法应用2-DE技术对人肺腺癌细胞系A549细胞总蛋白进行分离,获得蛋白质表达谱;应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)结合生物信息学进行蛋白质鉴定。结果3块胶平均蛋白斑点数为1 138±49,平均匹配点数为986±32,匹配率为85.8%。随机选取背景清晰、分辨清楚、蛋白含量较高的20个斑点进行MALDI-TOF-MS分析,共获得了18个肽质量指纹图谱(PMF)。将PMFs质量数据通过Aldente软件查询SWISS-PROT数据库,根据匹配片段及氨基酸序列覆盖率等,初步鉴定出15种蛋白质。根据功能,这些蛋白质可分为:①基本代谢相关的酶类:果糖2-磷酸醛缩酶、视网醛脱氢酶1(RALDH1)、吡多醛激酶;②细胞骨架类:蛋白细胞角蛋白8(CK8)、-β2链微管蛋白;③应激相关蛋白:蛋白二硫化物异构酶A3(PDIA3);④信号转导分子:膜联蛋白1(ANX1)、膜联蛋白4(ANX4);⑤分子伴侣:热休克蛋白60(HSP60)、热休克蛋白-β1、抑制素(PHB);⑥转录及翻译相关蛋白:不均一性核糖核蛋白H(hnRNP H);⑦杂类:Rgr protein、NPM、PCBP1。结论应用2-DE/MALDI-MS方法获得了较为理想的人肺腺癌细胞系A549细胞2-DE蛋白质表达谱,初步鉴定了15种蛋白质。     

PtenL/LMEFs与Pten△/△MEFs细胞系的差异表达蛋白质组分析

目的研究PtenL/LMEFs与Pten△/△MEFs细胞的蛋白表达差异。方法运用双向电泳技术比较PtenL/LMEFs与Pten△/△MEFs细胞的蛋白表达差异,6个差异蛋白进行胶内酶切后运用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行质谱分析,肽质量指纹图谱检索数据库后5个蛋白得到鉴定。结果同对照PTEN野生型细胞PtenL/LMEFs相比,磷酸甘油酸变位酶1(phosphoglycerate mutase 1,PGAM1)和肽脯氨酰顺反异构酶C(pepti-dyl-prolyl cis-trans isomerase C,cyclophilin C)在Pten△/△MEFs细胞中表达上调而Transgelin 2蛋白在Pten△/△MEFs细胞中表达下调。经鉴定已知蛋白点B和F都是过氧化物氧化还原酶6(Peroxiredoxin-6),蛋白点B在Pten△/△MEFs细胞中表达而在Pten△/△MEFs细胞中检测不到,蛋白点B和F的分子质量相似而等电点不同,可能是由于翻译后修饰。结论同对照PTEN野生型细胞PtenL/LMEFs相比,PTEN缺失的Pten△/△MEFs细胞有明显的差异性蛋白表达谱。PTEN的缺失引起细胞内多种蛋白表达改变,这些表达改变的蛋白可能与PTEN缺失后细胞癌变相关。     

丙型肝炎患者血清蛋白质组差异表达的初步研究

目的观察丙型肝炎病毒(HCV)患者血清蛋白质组的变化情况,为研究丙型肝炎的发病机制及治疗提供新的线索。方法收集丙型肝炎患者和健康对照者血清,去除血清中高丰度蛋白;应用双向凝胶电泳技术构建2组研究对象血清二维电泳图谱,Image Master软件分析所得图谱,寻找差异蛋白质点;基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法对2组间比较所得目标蛋白质点进行质谱鉴定。结果获得了HCV患者血清蛋白质双向电泳图谱,对表达差异2倍以上进行质谱鉴定,共鉴定出15种蛋白质。结论成功鉴定了15个HCV相关蛋白质,为进一步研究其发病机制及治疗手段提供了实验基础。     

胎鼠与成鼠脊髓蛋白质组图谱的构建及其差异分析

目的初步建立并优化用于脊髓组织蛋白质组分析的双向电泳技术。应用双向电泳技术建立胎鼠与成鼠脊髓蛋白质组图谱,并对两者的差异进行比较,从整体水平上探究成鼠脊髓丧失再生能力的蛋白质基础。方法以大鼠脊髓为研究对象,应用以固相pH梯度等电聚焦为第一向、均一水平十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳为第二向的双向电泳体系,对样品制备、电泳参数、染色等技术环节中影响双向电泳分辨率的关键因素进行一系列的优化。采用ImageMaster 2D Elite图像分析软件对获得的胎鼠与成鼠脊髓蛋白质组2-DE图谱进行图像分析,比较两者在蛋白质组表达上的差异。结果在此优化的实验条件下,获得了质量较好的脊髓组织蛋白质组双向电泳图谱。胎鼠脊髓蛋白质组图谱经图像分析后,可检测到838个蛋白点,成鼠脊髓蛋白质组图谱可检测到847个蛋白点。对胎鼠与成鼠脊髓蛋白质组匹配差示图谱的分析发现,两者间存在813个差示蛋白。结论通过对各种条件的优化,初步建立了脊髓组织2-DE技术。对胎鼠与成鼠脊髓蛋白质组的比较发现,两者存在明显差异。胎鼠与成鼠脊髓蛋白质组差示图谱的建立,为进一步筛选、鉴定与脊髓再生能力丧失有关的蛋白,并探究其作用机制打下了基础。     

胎儿生长受限子代大鼠与正常大鼠海马蛋白质组双向电泳图谱比较

目的 比较胎儿生长受限(FGR)子代大鼠与正常大鼠海马蛋白质组双向电泳图谱的差异,探索蛋白质组学技术在FGR引起子代神经系统发育异常的研究中应用的可能性.方法 建立SD大鼠的FGR模型,分离子代大鼠海马组织并提取总蛋白;进行双向电泳,比较FGR子代大鼠与正常大鼠海马组织的蛋白质表达差异.结果 FGR子代大鼠与正常大鼠海马组织双向电泳图谱分别检出647和626个蛋白点,对2张电泳图进行匹配后发现有18个蛋白点仅在FGR子代大鼠海马蛋白双向电泳图谱中表达,28个蛋白在2组大鼠海马组织中含量发生了3倍以上的变化,其中FGR组上调25个,下调3个.结论 初步建立了FGR动物模型比较蛋白质组学的技术方法;FGR子代大鼠海马蛋白质组与正常大鼠存在明显差异,差异点的发现为深入研究FGR引起子代高级神经活动异常的发病机制提供了有益的线索.