重组人细胞角蛋白9 cDNA的原核表达及纯化

目的克隆人细胞角蛋白CK9的cDNA,通过原核表达系统表达融合蛋白并进行纯化和鉴定。方法从人角质形成细胞系(HaCaT)中提取RNA,以RT-PCR反转录cDNA,使用特异性引物PCR扩增出人CK9编码区全长并克隆到pET-28a载体上,再用IPTG诱导融合蛋白his-CK9的表达。表达的融合蛋白通过Ni 2+亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果测序鉴定构建表达载体中CK9的cDNA序列正确;融合蛋白his-CK9可在大肠杆菌中诱导表达;纯化的融合蛋白his-CK9纯度较高;纯化的融合蛋白his-CK9可与商品化CK9抗体特异性结合。结论成功构建原核表达载体pET-28a-CK9,并成功诱导及纯化融合蛋白his-CK9。     

人CAP1蛋白真核表达及细胞定位与功能

目的构建CAP1蛋白真核表达质粒并使之在细胞内得以表达,确定CAP1蛋白在细胞中的定位及其对细胞迁移的影响。方法以HeLa细胞cDNA为模板,经PCR获取CAP1编码区cDNA,将该编码区cDNA序列插入pCMV-Myc质粒中,构建带Myc标签的真核表达重组质粒。重组质粒转染至293细胞中,Western blot方法检测其在真核细胞内的表达;重组质粒转染HeLa细胞,免疫荧光法检测其细胞内的定位,划痕实验观察其对细胞迁移的影响。结果成功构建了CAP1真核表达重组质粒,并在真核细胞内成功表达,确定CAP1定位于细胞质中,划痕实验证明CAP1过表达的细胞迁移能力明显下降。结论在真核细胞中成功表达了CAP1重组质粒且CAP1定位于细胞质,其过表达对细胞迁移有抑制作用,为研究CAP1的生理功能奠定实验基础。