Apoptin原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

目的构建Apoptin的原核表达载体,并制备抗原物质Apoptin融合蛋白。方法在获得Apoptin融合基因的基础上,成功构建了Apoptin的高效原核表达载体pET-28a( )-Apoptin,将该质粒转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)受体菌中,以IPTG对其进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白。结果转化有Apoptin的原核表达载体pET-28a( )-Apoptin的大肠杆菌E.coliBL21(DE3)经IPTG诱导后,经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约17 000的位置出现目的蛋白条带,大小与Apoptin融合蛋白一致。结论Apoptin原核表达载体pET-28a( )-Apoptin能够表达出Apoptin融合蛋白,为进一步的Apoptin研究和制备Apoptin抗体奠定了基础。     

Microfluidics-based assay on the effects of microenvironmental geometry and aqueous flow on bacterial adhesion behaviors

Abstract A new microfluidic system with four different microchambers （a circle and three equilateral concave polygons） was designed and fabricated using poly（dimethylsiloxane） （PDMS） and the soft lithography method. Using this microfluidic device at six flow rates （5, 10, 20, 30, 40, and 50 μL/h）, the effects of microenvironmental geometry and aqueous flow on bacterial adhesion behaviors were investigated. Escherichia coli HB101 pGLO, which could produce a green fluorescent protein induced by L-arabinose, was utilized as the model bacteria. The results demonstrated that bacterial adhesion was significantly related to culture time, microenvironment geometry, and aqueous flow rates. Adhered bacterial density increased with the culture time. Initially, the adhesion occurred at the microchamber sides, and then the entire chamber was gradually covered with increased culture time. Adhesion densities in the side zones were larger than those in the center zones because of the lower shearing force in the side zone. Also, the adhesion densities in the complex chambers were larger than those in the simple chambers. At low flow rates, the orientation of adhered bacteria was random and disorderly. At high flow rates, bacterial orientation became close to the streamline and oriented toward the flow direction; All these results implied that bacterial adhesion tended to occur in complicated aqueous flow areas.The present study provided an on-chip flow system for physiological behavior of biological cells, as well as provided a strategic cue for the prevention of bacterial infection and biofilm formation.     

远程氩等离子体对医用聚四氟乙烯表面灭菌与改性的研究

目的研究远程氩等离子体对医用聚四氟乙烯(PTFE)表面的灭菌及改性。方法通过载体定量灭菌实验测定远程氩等离子体对PTFE表面大肠杆菌的杀灭效果,并利用接触角测量、质量损失率计算和X射线光电子能谱分析(XPS)研究灭菌前后PTFE表面结构、性能的变化。结果在放电功率100 W,放电时间120 s,氩气流量20 cm3/min的条件下,远程及常规氩等离子体均可有效灭活大肠杆菌(GE≥3.769);但经远程氩等离子体灭菌后,PTFE表面的亲水性(水接触角为58.5°)明显优于常规氩等离子体灭菌后的PTFE表面(水接触角为70.5°),同时受损及降解程度低(表面质量损失率仅为11.8%)。远程氩等离子体可以在一定程度上抑制电子、离子的刻蚀作用,强化自由基反应,对PTFE表面的脱氟作用更强,从而引入更多的含氧基团。结论远程氩等离子体在有效杀灭大肠杆菌的同时,可使PTFE表面获得更好的改性效果。     

rep-PCR法在检测产超广谱β内酰胺酶大肠艾希氏菌院内流行中的应用

目的分析重复序列引物聚合酶链反应(rep-PCR)的优化条件,并采用本方法分析本院呼吸科病房不同患者痰标本中分离到的产超广谱β内酰胺酶(ESBL)大肠杆菌是否起源于同一菌株。方法用双纸片确定法测定是否产ESBL;用K-B法测定对抗生素的敏感程度;选用肠道菌广泛存在的基因间重复片断为引物进行扩增,并对实验条件进行优化;对产ESBL大肠艾希氏菌进行基因分型分析。结果建立了rep-PCR法方法,显示可将大肠艾希氏菌扩增出丰富的区带。分离到的22株产ESBL大肠艾希氏菌分属3个基因型。结论rep-PCR法可用于医院院内感染的流行病学调查。     

人杀菌渗透增强性蛋白N末端片段在大肠杆菌中的表达

目的构建表达人杀菌渗透增强性蛋白(BPI)N-端193个氨基酸的重组表达质粒,诱导表达BPI193重组蛋白。方法应用RT-PCR的方法从HL-60细胞内扩增出BPI氨基端1-193个氨基酸的基因序列,克隆入T载体。将BPI193基因片段定向克隆入原核表达载体PET-28a中,构建重组的原核表达质粒PET-BPI193,转化大肠杆菌BL21菌株,用IPTG诱导表达蛋白。应用SDS-PAGE检测蛋白表达情况,计算机薄层扫描分析蛋白占菌体总蛋白百分比;Western-blot技术检测表达蛋白的特异性。结果从HL-60细胞中扩增得到579bp的BPI193基因片段,构建了T-BPI193亚克隆和PET-BPI193重组表达质粒。转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导,经SDS-PAGE检测表明,成功表达了6His-BPI193融合蛋白。计算机薄层扫描分析表达量占菌体总蛋白的12%。Western-blot检测显示表达产物具有特异性。结论成功构建了PET-BPI193重组表达质粒。在大肠杆菌BL21内,诱导获得了BPI193与组氨酸融合表达的重组蛋白。     

丙型肝炎病毒C区截短型基因原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

目的建立稳定表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的原核表达系统,获得高产量的纯化核心蛋白。方法应用多聚酶链反应(PCR),以HCV-H株全长cDNA序列为模板,扩增获得C区羧基端部分缺失的基因片段,克隆入原核表达载体pBVIL1,构建原核表达载体pBVIL1-Ct,转化HB101宿主菌,通过温度诱导表达截短型C蛋白。结果扩增得到目的基因长度为462bp,构建pBVIL1-Ct表达载体,在HB101宿主菌中通过温度诱导获得稳定表达,表达蛋白占菌体总蛋白含量的24%。Western-Blot及ELISA检测证实表达产物可与HCV患者阳性血清发生特异性结合反应。结论羧基端部分缺失的HCV C区基因片段可在大肠杆菌中稳定表达并具有良好的反应原性。     

论致病性大肠杆菌(EPEC)的致病机理

由于分子和细胞生物学方法的出现,对EPEC的致病机理有了更好的了解,EPEC侵入体外培养的组织细胞,但是一般认为这不会发生在体内主要是由一种超微损伤介导的,细菌通过这种超微损伤从而与原生质膜紧密接触,导致肠刷状缘局部破坏和原生质膜变形。