人B7.2 cDNA的克隆及其真核表达

为克隆人 B7.2 c DNA,构建 B7.2真核表达质粒 ,并在哺乳动物细胞中表达。分离正常人淋巴结淋巴细胞 ,经 LPS诱导后 ,以 RT- PCR,克隆 B7.2 c DNA;构建真核表达质粒 p BCMGSNeo- B7.2 ,转染哺乳细胞 ,进行表达。结果成功克隆了 B7.2c DNA,并经测序证实 :所构建的 B7.2抗原真核表达质粒可在哺乳动物细胞中高效表达。表明经 LPS诱导的人淋巴细胞可表达 B7.2 m RNA,所建立的 p BCMGSNeo-B7.2哺乳动物真核表达质粒 ,可供进一步研究 B7.2结构和功能。     

编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP-3表位的cDNA的克隆

目的克隆出针对表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)PEP-3表位的cDNA片段,为高表达EGFRvⅢ肿瘤的免疫治疗奠定基础。方法根据PEP-3的碱基序列设计出有12对互补碱基的正负引物,正负引物互为模板进行PCR扩增,制备出两端含酶切位点的PEP-3 cDNA片段,再将扩增的PCR产物亚克隆于载体pGEM-T Easy构建重组质粒pGEM-T Easy/PEP-3。结果经限制性内切酶酶切鉴定和DNA测序证实,编码PEP-3的cDNA片段被成功扩增并亚克隆于载体pGEM-T Easy中。结论成功克隆了编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP-3表位的cDNA片段。     

葎草花粉cDNA表达文库的构建和初步鉴定

目的构建葎草花粉cDNA表达文库,为进一步筛选葎草花粉的主要致敏蛋白组分、制备重组变应原奠定基础。方法采集新鲜葎草花粉,过筛后液氮保存,利用Trizol法抽提葎草花粉总RNA,纯化后PCR法反转录合成cDNA。经SfiⅠ酶切,过凝胶柱层析,去除小于400 bp的片断,收集大于400 bp的cDNA片段,加工后与λTripIEx2连接,文库体外包装,取出一小部分感染宿主菌XL1-Blue MRF,检测文库容量;PCR分析插入的cDNA片段的大小及多样性。结果成功构建一个含有5×105重组子的葎草花粉表达文库,重组率为90%,平均插入片段长度约为1.02 kb。结论所建文库容量及插入片段大小合适,适用于筛选克隆的目的cDNA。     

人UCA1基因新剪接变异体全长cDNA序列的克隆

目的克隆新的UCA1剪接变异体全长cDNA序列,为研究其可变剪接机制奠定基础。方法用电子克隆技术和cDNA序列末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)扩增细胞系BLZ-211cDNA并进行产物测序和序列拼接。结果新克隆的UCA1剪接变异体全长cDNA序列为2 202bp。结论综合采用电子克隆技术与RACE技术是获得全长cDNA序列的有效方法,为该基因的后续可变剪接机制的研究奠定了基础。     

K562细胞cDNA表达文库的构建和鉴定

目的　构建K5 6 2细胞表达型cDNA文库。方法　提取K5 6 2细胞总RNA ,分离mRNA ,反转录合成双链cDNA ,消平cDNA末端 ,连接EcoRⅠ适配子 ,磷酸化EcoRⅠ适配子 5’端 ,Sephacryl S4 0 0柱除去小于 4 0 0bpcDNA片段 ,与去磷酸化的λgt11噬菌体连接 ,体外包装后建成cDNA文库。取出 1μL倍比稀释感染E .coliY10 90 ,测定文库大小、重组率 ,并以PCR鉴定cDNA插入片段的大小。结果　构建成含 1.0 2× 10 6重组子的K5 6 2细胞cDNA文库 ,重组子平均插入外源片段长约 1.3kb。结论　所建文库合格 ,适合用于筛选目的cDNA克隆。     

法国梧桐花粉的部分纯化及其主要变应原免疫活性分析

目的　对法国梧桐花粉变应原进行部分纯化并对其主要变应原免疫活性进行分析。方法　采用凝胶层析法分离纯化法国梧桐花粉变应原 ,经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测收集到的主要峰段的蛋白质分子质量 ,并对 7例法国梧桐花粉过敏支气管哮喘患者血清进行免疫印迹分析。结果　法国梧桐花粉变应原粗制液经SephadexG 10 0层析柱洗脱得两个洗脱峰 ,第一峰及第二峰升段富含蛋白 ;收集各段进行SDS PAGE电泳 ,第一峰升段、峰段、降段电泳图相似 ,主要含分子质量为 2 2～ 71ku之蛋白质 ,第二峰升段以分子质量为 14～ 16ku之蛋白质为主。电泳结果清晰显示 6条蛋白区带 ,分子质量分别为 71、5 0、35、39、2 2、16ku。免疫印迹分析可见 4条sIgG反应带 ,分子质量为 5 0、39、2 2、16ku。结论　法国梧桐花粉变应原含 6种主要蛋白成分 ,第一峰蛋白质含量高 ,为主要致敏组分 ;第二峰蛋白质含量少 ,为次要致敏组分。     

A NEW METHOD TO CONSTRUCT A FULL-LENGTH cDNA LIBRARY OF HUMAN NORMAL BLADDER TISSUE

ThepurposeoftheHumanGenomeProjectistounravelthe geneticinstructionsencodedbygenes.Identificationof protein codingandfunc tionalsequenceswithin genomeDNAcomplementthephysicalandgeneticmappingwork ,whichlaysfoundationforfurtherresearchintocomplexphe nomenaofgrowth ,development,differentiation ,carcinogenesis,etc.ThesearchforgenesresponsibleforhumandiseasesandbiologicalfeaturesandthestudiesoftheirstructuresandfunctionsrelyontheavailabilityofhighfidelitycDNAlibrariesfromvariouscelltypesandtissu…     

霜天蛾cDNA表达文库的构建和初步鉴定

目的构建霜天蛾cDNA表达文库,为进一步筛选霜天蛾主要变应原、制备重组变应原奠定基础。方法利用Trizol法抽提霜天蛾RNA,经过Oligo(dT)纤维素柱纯化后得到mRNA,反转录合成dscDNA,连接EcoRⅠ接头,末端磷酸化,XhoⅠ消化,将双末端黏性化的双链dscDNA经过凝胶柱层析,收集大于400bp的cDNA片段,加工后与UniZAPXRVector连接,经过体外包装,感染宿主菌,构建cDNA文库,检测文库容量和重组效率,并采用PCR方法对插入的cDNA片段大小进行分析。结果成功构建了一个含有5×105重组子的霜天蛾表达文库,重组率为67%,平均插入片段长度约为1.49kb。结论所建文库容量及插入片段大小合适,适用于筛选目的cDNA克隆。     

纯化葎草花粉变应原免疫治疗的研究

目的　观察纯化草花粉变应原特异性免疫治疗 (SIT)的疗效。方法　采取凝胶过滤方法部分提纯草花粉变应原。将 86例季节性草花粉过敏性哮喘患者随机分为纯化草花粉变应原SIT观察组 (A组 )及粗制变应原SIT对照组 (B组 ) ,采取双盲法 ,为时半年。观察临床疗效、副反应 ,以及SIT前后的T淋巴细胞亚群、皮肤试验 (IT)风团直径、嗜碱性粒细胞脱颗粒试验 (HBDT)指数及特异性IgE (sIgE)指数均值。 结果　A组总有效率 90 .7%(39/ 4 3) ,B组 79.1% (34/ 4 3,P <0 .0 5 )。A组SIT后仅 1例出现轻度副反应。两组SIT后CD4细胞及CD4/CD8显著降低 ,CD8细胞显著升高 ,且A组变化更明显。两组SIT后ID风团直径、HBDT指数及sIgE指数均值都较SIT前明显下降 (P均 <0 .0 1) ;A组SIT后上述指标下降程度较B组更明显 (P均 <0 .0 1)。结论　纯化草花粉变应原SIT的疗效优于粗制变应原 ,副作用小。提示纯化草花粉变应原SIT后对变态反应抑制性强于粗制变应原。