慢性乙肝肝硬化血小板减少与疾病相关性的研究

目的探讨慢性乙肝肝硬化血小板减少与血清血小板生成素(thrombopoietin,TPO)浓度及HBV-DNA载量之间的关系。方法测定26例血小板减少的慢性乙肝肝硬化肝功能代偿期患者、73例血小板减少的慢性乙肝肝硬化肝功能失代偿期患者、26例血小板正常的慢性乙肝肝硬化患者及25例健康对照的血小板参数;用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清TPO浓度;荧光定量PCR法测定99例血小板减少的慢性乙肝肝硬化患者的HBV-DNA水平。结果与健康对照组相比,血小板减少的慢性乙肝肝硬化肝功能代偿期组及慢性乙肝肝硬化肝功能失代偿期组的血小板显著降低(P<0.01),血小板减少的慢性乙肝肝硬化肝功能失代偿期组的血清TPO浓度显著升高(P<0.05),而血小板减少的慢性乙肝肝硬化肝功能代偿期组与血小板正常的慢性乙肝肝硬化组及健康对照组的血清TPO浓度相比均无统计学差异(P>0.05)。血小板减少的慢性乙肝肝硬化肝功能代偿期组、失代偿期组的血清TPO浓度与外周血小板计数之间均无相关性(P>0.05)。与HBV-DNA水平小于103IU/mL的血小板减少的慢性乙肝肝硬化患者组比较,HBV-DNA水平在103～106IU/mL及HBV-DNA水平大于106IU/mL的血小板均显著降低(P<0.05)。结论血小板减少可以作为评价慢性乙肝肝硬化的指标,但不能区别肝硬化肝功能处于代偿期还是失代偿期。慢性乙肝肝硬化血小板减少是多因素影响的,血清TPO水平在慢性乙肝肝硬化中增高,其对血小板减少的影响不大,而乙肝病毒载量高低对血小板减少的影响较大。     

截短血小板生成素cDNA在中华仓鼠卵巢细胞中的表达

目的　将具有全长血小板生成素 (TPO)活性的N端截短血小板生成素cDNA(T1 84)作为目的基因 ,在中华仓鼠卵巢细胞 (CHO)中成功表达。方法　将N端截短血小板生成素cDNA克隆入以二氢叶酸还原酶 (DHFR)为筛选扩增基因的 pDC B真核表达载体 ,通过不断提高MTX浓度 ,促进N端截短血小板生成素在CHO细胞中的表达。结果　构建了N端截短血小板生成素cDNA的真核表达质粒 ,并能在CHO细胞中高效表达。结论　N端截短血小板生成素cDNA在CHO细胞中成功表达 ,其产物具有全长TPO的活性。     

血小板生成素基因的克隆及在原核细胞的表达

目的　克隆人血小板生成素 (hTPO)基因 ,并使其在原核细胞中获得表达。方法　先从人胚胎肝脏中提取总RNA ,进行RT -PCR获得编码氨基端 1 95个氨基酸残基的hTPO1 95cDNA。将该片段亚克隆至pGEM -Teasy克隆质粒中 ,以双脱氧链末端终止法对克隆质粒直接测序。接着将hTPO1 95cDNA插入到原核表达质粒 pET2 8-a中 ,转化大肠杆菌BLR2 1 (DE3) ,进行诱导表达 ,以SDS -PAGE方法及免疫印迹法进行检测。结果　得到的hTPO1 95cDNA与文献报道的序列完全一致。经诱导后hTPO基因在大肠杆菌中获得表达 ,目的蛋白占总菌体蛋白约 1 0 % ,以免疫印迹法证实表达产物正确。结论　得到hTPO1 95cDNA ,并在原核细胞中获得表达 ,得到截短形式的rhT PO1 95。