HBV Pre S1蛋白质在酵母细胞中具有转录激活功能

为探讨应用双杂交体系统克隆与HBVPreS1蛋白质结合的肝细胞受体的可行性，我们构建了HBVPreS1蛋白质与酵母GAL4DNAbindingdomain融合蛋白质酵母表达质粒。通过应用该质粒转化酵母菌株SFY526，检测报道基因产物五半乳糖苷酶活性，结果表明HBVPreS1蛋白质在酵母细胞中具有转录激活功能。能否去除PreS1蛋白质转录激活功能区域但却保留其与肝细胞受体的结合区域用于酵母双杂交体系统筛选肝细胞cDNA文库、克隆与PreS1蛋白质结合的肝细胞受体尚需进一步实验探讨。     

补硒对克山病病区低硒居民血清锌、铜、铁、锰、钙和镁的影响

目的　探讨补硒对克山病病区居民有关元素水平的影响。方法　给克山病病区 1 3～ 1 5岁居民每日口服硒酵母或亚硒酸钠 2 0 0 μg或普通酵母片 1 2周后 ,测定其血清和红细胞硒含量以及血清锌、铜、铁、锰、钙和镁含量。结果　给病区低硒居民补充亚硒酸钠和硒酵母均能明显提高血浆和红细胞硒水平 ,但硒酵母提高血浆和红细胞硒水平作用强于亚硒酸钠 ;补充亚硒酸钠或硒酵母均对病区居民血清锌、铜、铁、锰、钙和镁含量无明显影响。结论　补硒可明显提高病区居民血硒水平 ,但硒水平并不影响血清锌、铜、铁、锰、钙和镁元素的含量     

TRANSCRIPTION ACTIVATION BY HBV PRE SI PROTEIN

ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮＢＹＨＢＶＰＲＥＳＩＰＲＯＴＥＩＮＸｉａｏＳｈｅｎｇｘｉａｎｇ；Ｔ．Ｓ．Ｂ．Ｙｅｎ（ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＰａｔｈｏｌｏｇｙ，ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖ．ｏｆ...     

鸡白细胞介素2在毕赤酵母细胞中的表达

目的　利用Pichia酵母真核细胞表达系统表达重组鸡白细胞介素 2 (IL 2 ) ,为大量制备鸡IL 2奠定基础。方法　将ConA激活的鸡脾脏T淋巴细胞中扩增得到的我国地方品种萧山鸡IL 2基因 ,克隆入pPIC9载体中构建重组质粒。将重组质粒电转化毕赤酵母GS115感受态细胞 ,甲醇诱导蛋白质表达。结果　SDS PAGE和Westernblot均在 30ku处检测到特异条带。结论　表明重组鸡IL 2基因在毕赤酵母GS115中获得表达     

酵母双杂交系统筛选HBV PreS1相互作用蛋白

目的利用Sos招募系统(SRS),构建含HBV PreS1基因的酵母双杂交诱饵载体,筛选人肝细胞与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,进一步探讨HBV侵入肝细胞的机制。方法以HBV ayw亚型全长质粒PCP10为模板,PCR扩增HBV PreS1基因,克隆到酵母表达载体pSos中,构建诱饵质粒pSos-PreS1,将其转化cdc25酵母感受态细胞,提取酵母蛋白质进行Western blot分析,证实其在酵母细胞中的表达;将pSos-PreS1分别与pMyr Lamin C、pMyr SB共转化酵母,证实诱饵蛋白无自激活作用。将pSos-PreS1与人肝cDNA文库共转化cdc25酵母感受态细胞,通过营养及温度选择性培养筛选阳性菌落,扩增阳性菌落目的基因并测序。结果成功构建了HBV PreS1基因酵母双杂交诱饵载体pSos-PreS1,筛选得到5个准阳性克隆,序列分析表明其分别与人类钾通道调制因子1(KCMF1)、细胞色素C、VitD结合蛋白、人源去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)和人白蛋白具有高度同源性。结论利用SRS筛选出5个可能与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,为进一步了解HBV侵入肝细胞的机制奠定了基础。     

人羧肽酶A1的毕赤酵母可溶表达

目的应用毕赤酵母表达系统表达人羧肽酶A1(carboxypeptidase A1,CPA1)蛋白。方法从pGEX-CPA1重组质粒中扩增出CPA1基因,亚克隆入酵母表达载体pPIC9K,酵母重组表达载体pPIC9K-CPA1电转化入毕赤酵母SMD1168,并进行营养缺陷筛选和G418抗性筛选,对高拷贝整合的重组酵母表达菌株诱导表达。结果构建得到酵母融合重组表达载体pPIC9K-CPA1,经G418浓度梯度筛选得到串联整合16个重组表达载体的重组酵母表达菌株,诱导表达后得到CPA1蛋白。结论在毕赤酵母中成功表达了CPA1,为进一步研究CPA1在抗体导向酶-前体药物疗法中的应用奠定了基础。     

硒对克山病病区低硒居民红细胞GPX蛋白的影响

给克山病病区１４岁～１６岁居民每日口服２００μｇ硒（亚硒酸钠或硒酵母）１２周测定红细胞硒含量、谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＰＸ）活性和ＧＰＸ蛋白水平，以探讨补硒对人红细胞ＧＰＸ蛋白的影响。结果说明：①硒水平不仅可增加克山病病区人体红细胞ＧＰＸ活性，而且对ＧＰＸ蛋白水平也有提高作用；（②硒酵母硒对红细胞ＧＰＸ蛋白水平的增高作用比亚硒酸钠硒明显。     

兔Oddi氏括约肌细胞BK通道Alpha亚基在Pichia酵母中的高效表达、纯化和鉴定

目的用巴斯德毕赤酵母系统表达兔Oddi氏括约肌(SO)细胞BK通道α亚基,并进行纯化和鉴定。方法采用RTPCR扩增编码兔SO细胞BK通道α亚基B细胞表位区基因的cDNA,经测序正确将其克隆入酵母表达载体pPIC9K,以电穿孔法转化酵母GS115。经MD平板筛选重组子、G418筛选鉴定后,甲醇诱导表达,镍离子亲合层析法对表达上清进行纯化,进行SDSPAGE和免疫印迹分析。结果用RTPCR扩增出约1497bp的兔SO细胞BK通道α亚基基因的cDNA。序列分析显示,扩增序列与已发布的新西兰大白兔骨骼肌BK通道α亚基的cDNA序列完全一致。SDSPAGE显示本系统表达的α亚基融合蛋白Mr约为55000,表达量约为55mg/L,纯度为96%。Westernblot检测证明,该α亚基融合蛋白可与兔BK通道α亚基多克隆抗体特异性结合。结论克隆了编码兔SO细胞BK通道α亚基B细胞表位区基因的cDNA,并在毕赤酵母中成功地表达了该蛋白,为进一步研究BK通道提供了物质基础。     

不同硒含量人工合成饲料喂养大白鼠尿中氨基多糖测定

本实验用不同硒含量串珠酵母人工合成饲料喂养大白鼠,分别于实验前、实验30天及实验40天收集大白鼠24小时尿,尿中酸性氨基多糖含量测定采用氧氯化锆沉淀咔唑硫酸法进行葡萄糖醛酸定量。其结果经F检验各组均无显著差异。发现有以下两个趋势:1.实验30天24小时尿葡萄糖醛酸含量各组普遍升高,40天趋于下降,尤以低硒组显著;2.饲料硒越高,糖醛酸排泄量也越高,与血硒含量作相关分析,各批均呈正相关,但无显著差异。     

丙型肝炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及人胎肝cDNA文库的扩增、纯化和鉴定

目的用含丙型肝炎病毒核心(HCV core)蛋白的cDNA片段构建酵母双杂交诱饵载体,并进行人胎肝cDNA文库的扩增、纯化和鉴定。方法PCR扩增含HCV core蛋白不同大小的cDNA片段,分别克隆入pUC19质粒,经测序正确后,再亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中。扩增人胎肝cDNA文库并纯化、鉴定。结果获得含HCVcore蛋白的cDNA片段,并成功克隆入pGBKT7中。待转化的人肝cDNA文库滴度在5×108左右,纯化后的质粒DNA质量浓度约1 g/L。用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切显示插入片段大小不一。结论成功构建了核心蛋白的酵母双杂交诱饵载体;扩增、纯化的人胎肝cDNA文库的多样性很好,适合于筛选。为用酵母双杂交技术研究与HCV core蛋白相互作用的蛋白打下坚实基础。