| 野生型p27和核定位信号缺失型p27真核表达载体的构建及表达 |
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| 作者姓名： | 焦鑫艳 张英 盛秋 张妙 杨泽健 高小倩 赵谦 王博 刘培军 |
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| 作者单位： | 1. 西安交通大学第一附属医院转化医学中心;2. 陕西省肿瘤精准医学重点实验室;3. 西安交通大学第一附属医院消化内科;4. 西北工业大学医院;5. 西安交通大学第一附属医院耳鼻喉头颈外科 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金资助项目(No.81872272)；;陕西省重点研发计划资助项目(No.2015SF015,2019SF-147)； |
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| 摘 要： | 目的 构建人野生型p27(p27WT)和核定位信号缺失型p27(p27△NLS)的真核表达载体，并在HEK293T细胞中进行表达，为细胞中p27核浆定位的变化及其不同的生物学功能研究提供细胞基础。方法 提取人乳腺癌细胞系MCF7总RNA，反转录cDNA后，分别进行p27全长和非NLS区片段的PCR扩增，获得p27WT全长(CDKN1B,NM＿004064.5)和p27△NLS编码区序列，分别将其克隆至真核表达载体pCMV-Blank，经菌液PCR、双酶切和测序鉴定。电穿孔法转染HEK293T细胞，48 h时分别提取胞核蛋白和胞质蛋白，Western blotting检测p27在细胞质和细胞核中的蛋白表达。结果测序结果显示，真核表达载体pCMV-Blank中插入的p27WT序列和p27△NLS序列均与NM＿004064.5序列相一致。pCMV-p27WT转染HEK293T细胞后，细胞总p27蛋白表达显著增加，核浆分离检测发现其在细胞质和细胞核中均表达；而pCMV-p27△NLS转染HEK293T细胞的总p27蛋白表达也显著增加，核浆分离检测发现其主要在细胞质中表达。结论 成功构建人p27...
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| 关 键 词： | p27 CDKN1B 核定位信号序列 真核表达 |
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