| 摘 要： | 目的探讨融合蛋白CTLA4.FasL对肝前体细胞(LEPCs)增殖分化潜能的影响及抑制异种排斥反应的效应。方法克隆CTLA4.FasL基因,构建携带CTLA4.FasL基因与红色荧光蛋白(mCherry)双顺反子结构的重组慢病毒载体Lv-CTLA4.FasL-IRES-mCherry。优化慢病毒感染LEPCs的条件,建立高表达CTLA4.FasL的LEPCs,荧光显微镜观察mCherry的表达,Western blot检测CTLA4.FasL的表达,酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定细胞培养上清中CTLA4.FasL的浓度,水溶性四氮唑(WST-1)法检测细胞的增殖活性,Real time PCR(RT-PCR)检测干细胞相关基因CK19和c-Kit mRNA的表达,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)掺入法测定CTLA4.FasL-LEPCs在异种混合淋巴细胞培养体系中对大鼠淋巴细胞增殖的抑制作用。结果构建重组慢病毒载体Lv-CTLA4.FasL-IRES-mCherry,病毒滴度为2×108 TU/mL。在感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10,聚凝胺质量浓度是5μg/mL时,感染效率约90%。Western blot证实了CTLA4.FasL的表达,在细胞培养上清中其质量浓度约为(0.72±0.10)μg/mL。CTLA4.FasL-LEPCs细胞增殖活性未受到影响,CK19和c-Kit基因mRNA表达水平无变化。CTLA4.FasL-LEPCs细胞可显著抑制大鼠淋巴细胞的增殖(P<0.05)。结论构建成功的重组慢病毒载体Lv-CTLA4.FasL-IRES-mCherry可介导CTLA4.FasL基因在LEPCs中高效表达;CTLA4.FasL可有效地抑制异种排斥反应,同时不损害LEPCs增殖活性和分化潜能。
|
