人TSHR膜外区cDNA克隆及真核表达载体的构建

目的通过生物技术获得促甲状腺激素受体膜外区表达载体,为TSHR膜外区的研究提供有力工具。方法从人甲状腺组织中提取总RNA,RT-PCR分离得到TSHR膜外区cDNA,双酶切后插入真核表达载体pcDNA3.1(+)。结果经酶切鉴定、测序分析表明TSHR膜外区片段与GenBank提供的完全相同。结论成功构建了人TSHR膜外区真核表达载体。     

人促甲状腺激素受体A亚单位蛋白在昆虫细胞体系中的分泌性表达

目的 拟构建昆虫细胞分泌表达体系,在草地夜蛾卵巢细胞分泌性促甲状腺激素受体(thyroid stimulating hormone receptor, TSHR) A亚单位蛋白。方法 将TSHR A亚单位蛋白(22-289)和绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)基因连接到质粒,并通过转化、蓝白斑筛选获得重组杆粒,将其转染入sf9昆虫细胞收获重组杆状病毒,扩增并测定滴度。最终通过蛋白印迹实验鉴定重组蛋白的表达并优化表达条件。结果 在蛋白表达体系的构建过程中,PCR鉴定和测序均证实了重组质粒和重组杆粒序列的正确性。将重组杆粒转染入细胞后观察到病毒出芽迹象,空斑实验鉴定P1代病毒的滴度为2×10⁷pfu/m。蛋白印迹显示重组蛋白分子质量为55 ku,主要在培养基中。蛋白表达的最佳感染复数(multiplicity of infection, MOI)为1,最佳感染时程为72 h。结论 本研究构建了TSHR A亚单位的昆虫细胞杆状病毒表达体系,该体系能够外泌性表达分子质量为55 ku左右的蛋白TSHR 22-289,且蛋白能够成功...     

中国人丙型肝炎病毒复合细胞毒性T淋巴细胞多表位基因真核载体的构建及在COS-7细胞中的表达

目的 构建中国人丙型肝炎病毒(HCV)复合细胞毒性T淋巴细胞(CTL)多表位基因的真核表达载体,并观察其在真核细胞中的表达.方法 根据生物信息学方法筛选中国人的HCV多个CTL优势表位,合成复合多表位抗原基因(mcf);将其克隆入真核表达载体pEGFP-N1,转染COS-7细胞,在荧光显微镜下观察mcf-EGFP融合蛋白在细胞中的分布和定位,RT-PCR及Western blot检测其mRNA及蛋白表达.结果 成功构建了真核表达载体pEGFP-mcf.将构建的真核表达载体pEGFP-mcf转染 COS-7细胞后,绿色荧光分布于COS-7细胞胞质中;而转染空载体pEGFP-N1后,绿色荧光弥散分布于COS-7细胞胞核及胞质中.RT-PCR检测到转染细胞中mcf mRNA表达;Western blot结果证明合成mcf可在COS-7细胞中表达.结论 该真核表达载体的成功表达及鉴定,为下一步中国人的HCV复合CTL多表位疫苗的研究奠定了基础.     

人MCHR1真核表达载体构建及稳定转染HEK293细胞系的建立

目的构建人MCHR1真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染的HEK293细胞系。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HEK293细胞系,用RT-PCR、Western-blot检测MCHR1的表达。结果构建了pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体,建立了稳定转染的HEK293细胞系,并成功地表达了目的基因。结论真核表达载体成功构建和稳定转染HEK293细胞系的建立为进一步研究MCHR1的功能奠定了良好的实验基础。     

人促甲状腺激素受体胞外段的体外重组、蛋白高效表达及其与构象功能的关系

目的　TSH受体 (TSHR)是诱发自身免疫性甲状腺病 (autoimmunethyroiddisease ,AITD)的主要自身抗原。TSHR上TSH结合部位、自身抗体及主要的B细胞、T细胞表位均位于其胞外段部分。本研究利用基因重组方法 ,建立人TSH受体胞外段 (hTSHRecd)体外高效表达、纯化系统 ,用于Graves’病的临床及实验研究 ,探索体外表达的重组hTSHRecd蛋白的免疫生物活性与其空间构象的关系。方法　设计 1对hTSHRecd特异性引物 ,自PCRTTM3 hTSHR载体中PCR扩增合成hTSHRecd片段 ,经限制性内切酶BamHⅠ、SalⅠ消化 ,胶回收纯化后 ,重新构建于表达质粒 pQE 30中。用质粒电泳、限制性内切酶消化、PCR 3种方法鉴定重组质粒是否构建正确 ,并于E .coliM15细胞进行诱导表达。所表达的 6×His hTSHRecd融合蛋白经 12 0 g·L-1SDS PAGE ,Westernblotting鉴定。细菌培养产物经超声波破碎、裂解液裂解后利用Ni NTA树脂 ,经金属螯合层析法纯化 ,并经原位再折叠、透析、浓缩等处理。以ELISA、12 5I TSH结合抑制试验检测纯化蛋白与Graves’甲亢患者血清及TSH的结合活性。结果　经鉴定 ,重组质粒中含有以正确方向插入的 12 0 5bp的hTSHRecdcDNA基因片段。hTSHRecd融合蛋白约 4 7kD ,于 12 0 g·L-1SDS PAGE可见深染的特异性蛋白条带 ,可与Graves?     

人杀菌渗透增强性蛋白N末端片段在大肠杆菌中的表达

目的构建表达人杀菌渗透增强性蛋白(BPI)N-端193个氨基酸的重组表达质粒,诱导表达BPI193重组蛋白。方法应用RT-PCR的方法从HL-60细胞内扩增出BPI氨基端1-193个氨基酸的基因序列,克隆入T载体。将BPI193基因片段定向克隆入原核表达载体PET-28a中,构建重组的原核表达质粒PET-BPI193,转化大肠杆菌BL21菌株,用IPTG诱导表达蛋白。应用SDS-PAGE检测蛋白表达情况,计算机薄层扫描分析蛋白占菌体总蛋白百分比;Western-blot技术检测表达蛋白的特异性。结果从HL-60细胞中扩增得到579bp的BPI193基因片段,构建了T-BPI193亚克隆和PET-BPI193重组表达质粒。转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导,经SDS-PAGE检测表明,成功表达了6His-BPI193融合蛋白。计算机薄层扫描分析表达量占菌体总蛋白的12%。Western-blot检测显示表达产物具有特异性。结论成功构建了PET-BPI193重组表达质粒。在大肠杆菌BL21内,诱导获得了BPI193与组氨酸融合表达的重组蛋白。     

hGPx-1-198Leu真核表达载体的构建与鉴定及在H9C2细胞中的表达

目的构建含有人GPx-1基因Pro198Leu多态的真核表达载体,为深入研究GPx-1基因Pro198Leu多态在相关疾病中的作用与机制提供依据。方法采用全基因合成的方法合成含多态位点的人GPx-1基因cDNA片段,同时在基因5′端和3′端分别引入BamHⅠ和NotⅠ酶切位点,通过限制性内切酶酶切目的片段和真核表达载体pEGFPN3,再用T4DNA连接酶将含有目的基因的片段定向插入到载体pEGFP-N3真核人巨细胞病毒启动子下游。连接产物转化至DH5α中。挑取克隆、提取质粒进行鉴定。将hGPx-1-198Leu真核表达载体转染HEK293细胞,观察转染效率,并采用RT-PCR检测转染重组载体后细胞中GPx-1的mRNA表达水平。重组载体转染H9C2细胞,观察补硒之后的GPx-1表达情况。结果获得目的基因cDNA片段全长869bp,PCR和测序鉴定载体中含有人GPx-1-198Leu基因cDNA。重组载体转染HEK293细胞后检测到GPx-1的mRNA水平比未转染组及空质粒转染组明显升高,为深入研究GPx-1基因Pro198Leu多态在相关疾病中的作用与机制奠定了基础。H9C2细胞在转染后GPx-1蛋白水平升高并且随着硒浓度的升高而升高。结论成功构建了含Pro198Leu多态位点的hGPx-1真核表达载体,并且也插入了保证该基因有效表达的硒代半胱氨酸插入序列。     

肿瘤特异性Survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体的构建

目的 构建肿瘤特异性Survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体.方法 PCR扩增Survivin启动子,构建重组载体pGEMT/pSurv并酶切、测序鉴定.体外化学合成编码FAK shRNA寡核苷酸链并退火互补成双链,构建真核表达载体pGenesil-FAK shRNA并酶切、测序鉴定.用Survivin启动子替换pGenesil-FAK shRNA中的U6启动子,重组为Survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体pGenesil-pSurv-FAK shRNA.将pGenesil-pSurvFAK shRNA转染至肝癌细胞系HepG2,观察转染效率.48h后应用RT-PCR法检测转染重组质粒后HepG2细胞中FAK mRNA的表达变化.结果 成功构建了肿瘤特异性Survivin启动子驱动的真核表达载体pGenesil-pSur-FAKshRNA,转染至肝癌细胞HepG2后可明显下调HepG2细胞中FAK mRNA表达水平.结论 以Survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体能够有效下调肝癌细胞FAK的表达,为进一步以靶向干扰FAK表达为主要手段的肝癌联合治疗提供实验依据.     

幽门螺杆菌ahpC基因的克隆与原核表达

目的 构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)ahpC基因的原核表达系统,表达并纯化Ahp蛋白.方法 用PCR方法从中国分离株MEL-Hp27的染色体DNA中扩增出ahpC基因片段,将目的基因插入表达载体pET-30a中,构建重组质粒pET30a-ahpC.重组质粒经DNA测序鉴定后转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.采用镍离子亲和层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE鉴定.结果 PCR扩增的ahpC基因长度为594bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因与GenBank公布的序列相似性达99%;SDS-PAGE显示,经IPTG诱导出分子质量为23ku的目的蛋白,且产量较高.结论 成功构建了ahpC表达载体pET30a-ahpC,并在大肠杆菌中高效表达.