哮喘大鼠肺内神经生长因子的表达变化及与病理改变的关系

目的探讨神经生长因子(nerve growth factor,NGF)致哮喘大鼠肺内病理改变及被拮抗后肺内表达的变化,为哮喘的发病机制和治疗提供理论依据。方法随机将48只SD大鼠分为:正常对照组、哮喘组和抗NGF干预组,每组均16只。取肺组织在光镜下测量支气管基底膜厚度并计数黏膜下成纤维细胞的数目,HE染色观察气道病理改变并测量呼吸道平滑肌厚度;用免疫组化法检测肺组织NGF的表达。结果哮喘组肺组织NGF表达较对照组明显增强(P<0.01);NGF的表达与呼吸道平滑肌厚度有明显相关性;哮喘组呼吸道平滑肌厚度、网状基底膜厚度、黏膜下成纤维细胞数目及NGF的表达均高于对照组和抗NGF干预组(P<0.05);抗NGF干预组显著缓解上述变化(P<0.05)。结论支气管哮喘大鼠气道组织中NGF表达显著增加,并与呼吸道平滑肌厚度等有关,同时与支气管哮喘的气道炎症有明显相关,予抗NGF干预后可以抑制气道炎症。     

克拉霉素对激素反应性通路中组蛋白去乙酰化酶2及糖皮质激素受体的影响

目的观察克拉霉素对激素反应性通路中组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)及糖皮质激素受体(GR)的影响,探讨克拉霉素对烟雾暴露哮喘小鼠可能的治疗作用。方法选择BALB/c小鼠作为研究对象,通过卵蛋白致敏激发建立哮喘模型组(OVA组)、烟雾暴露哮喘组(SEA组)以及哮喘接触烟雾暴露后通过克拉霉素治疗组(CAM组),同时设立对照组平行比较。采用组织病理学检测各组小鼠肺组织炎症情况,并通过PCR检测肺组织中HDAC2mRNA的表达情况和Western blot检测肺组织中HDAC2和GR蛋白的表达。结果组织病理学观察OVA组和SEA组均存在肺组织气道炎症,其中SEA组纤毛被严重破坏,而CAM组炎症细胞浸润减弱。与CAM组相比,SEA组小鼠支气管肺泡灌洗液中IL-4和IL-8水平均显著提高(104.36±14.39 vs.65.49±10.82、681.35±66.18 vs.321.49±90.37,P=0.031、0.017)。CAM组HDAC2mRNA表达显著高于SEA组(0.062±0.013 vs.0.031±0.015,P=0.032)。Western blot检测结果显示,与CAM组相比,SEA组HDAC2蛋白(0.23±0.017 vs.0.49±0.022,P=0.033)和GR蛋白(0.19±0.014 vs.0.64±0.023,P=0.011)表达均显著降低。结论克拉霉素能抑制烟雾暴露的哮喘小鼠气道炎症反应,作用机制可能通过与GR相结合,影响下游HDAC2基因表达有关。     

树突状细胞Wnt/β-catenin信号通路对哮喘小鼠气道变态反应性炎症的调控作用

目的探讨Wnt/β-catenin信号通路对哮喘小鼠气道变态反应性炎症的调控作用。方法通过小鼠骨髓细胞诱导分化建立树突状细胞(DCs)体系,并用氯化锂(LiCl)和PKF118-310干预细胞,光镜下观察细胞形态;同种异体混合淋巴细胞反应检测DCs刺激淋巴细胞的增殖能力;Western blot方法检测DCs中GSK-3β和β-catenin蛋白的表达水平。选用BALB/c雌性小鼠为研究对象,使用OVA联合氢氧化铝构建哮喘模型,并用LiCl和PKF干预小鼠,干预结束后收集标本,观察支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数和嗜酸性粒细胞百分比;HE染色观察小鼠肺部变态反应性炎症情况;ELISA检测BALF、脾细胞培养上清液中干扰素-γ(IFN-γ)和白介素-4(IL-4)的含量及血清总IgE抗体水平;Western blot检测肺脏组织中Wnt/β-catenin信号通路的重要组分GSK-3β和β-catenin蛋白的表达变化。结果(1)LiCl组DCs对同种异体T细胞的刺激和促增殖能力明显弱于PKF组DCs(P<0.05);(2)LiCl组DCs中GSK-3β的蛋白表达水平明显低于PKF组,而其β-catenin的蛋白表达水平显著高于后者(P<0.05);(3)动物实验中,与哮喘组相比,LiCl组BALF中白细胞总数和嗜酸性粒细胞百分比均较低,而PKF组与此相反(P<0.05);(4)肺组织病理表明,LiCl组肺部炎症程度最轻,PKF组最重(P<0.05);(5)LiCl组小鼠BALF及脾脏中IL-4水平最低,IFN-γ水平最高;PKF组与此相反,哮喘组介于两者之间(P<0.05);(6)各组小鼠血清中总IgE含量,与正常对照组比较,实验组IgE显著升高(P<0.05);LiCl组总IgE水平明显低于哮喘组和PKF组(P<0.05);(7)LiCl组肺组织中GSK-3β的蛋白表达水平明显低于各组(P<0.05),而其β-catenin的蛋白表达水平显著高于各组(P<0.05),PKF组β-catenin的蛋白表达水平明显低于各组(P<0.05),哮喘组和PKF组之间GSK-3β的蛋白表达水平未见明显差异(P>0.05)。结论 LiCl和PKF118-310可通过调控哮喘小鼠肺组织中Wnt/β-catenin信号通路重要组分GSK-3β和β-catenin的蛋白表达而改变哮喘严重程度,为哮喘的治疗提供了新方向。     

18β-甘草次酸钠对变应性鼻炎大鼠鼻黏膜NF-κBp50及血清IL-4表达的影响

目的观察18β-甘草次酸钠(18beta-solidum glycrrhetinic acid, 18β-SGA)对变应性鼻炎(allergic rhinitis, AR)大鼠鼻黏膜中NF-κBp50及血清中白介素-4(IL-4)表达的影响。方法卵清蛋白致敏Wistar大鼠建立AR动物模型。造模成功后,将大鼠随机分为正常对照组、AR模型组、布地奈德组和18β-SGA低剂量(20 mg/kg)、高剂量(40 mg/kg)干预组,分别在给药干预2周和4周后取大鼠鼻黏膜和血清,免疫组化法观察NF-κBp50在大鼠鼻黏膜的分布,RT-qPCR和Western blot检测NF-κBp50 mRNA和蛋白相对表达量,酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测血清中OVA特异性sIgE(OVA-sIgE)及IL-4的表达。结果大鼠鼻黏膜中NF-κBp50主要表达在鼻黏膜假复层纤毛柱状上皮细胞、固有层的腺体细胞、血管内皮细胞、炎性细胞的细胞质、细胞核中。AR组大鼠较正常大鼠鼻黏膜中NF-κBp50 mRNA及蛋白的表达量增加(P<0.05),经18β-SGA或布地奈德干预后,其表达量减少(P<0.05)。AR组大鼠血清中OVA-sIgE、IL-4表达量较对照组升高(P<0.05),经18β-SGA或布地奈德干预后,IL-4表达量下降(P<0.05)。结论 18β-SGA可能通过抑制NF-κB信号通路活性,降低NF-κBp50表达,下调血清IL-4水平,从而发挥抗炎作用。     

高迁移率族蛋白B1和Toll样受体4与哮喘气道炎症的关系及维生素D的作用

目的探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)和Toll样受体4(TLR4)与气道炎症的关系及维生素D的作用。方法 BALB/c小鼠随机分为对照组、哮喘组和1,25-(OH)2D3干预组(每组8只)。采用HE染色观察小鼠肺组织病理学变化并应用计算机图像系统测定支气管壁厚度,采用免疫组化法观察肺组织HMGB1和TLR4表达,同时收集支气管肺泡灌洗液(BALF)和外周血,将BALF进行细胞学检测,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定BALF和外周血中HMGB1、TLR-4、白介素-4(IL-4)和干扰素-γ(IFN-γ)含量。结果哮喘组小鼠肺组织HMGB1和TLR4表达较强,干预组表达较弱。哮喘组BALF中白细胞总数及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞比例明显升高,单核/巨噬细胞比例明显下降(均为P<0.05);干预组BALF中白细胞总数及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞比例明显下降,单核/巨噬细胞比例明显上升(均为P<0.05)。哮喘组BALF和外周血中HMGB1、TLR4和IL-4含量均明显高于对照组,IFN-γ含量均明显低于对照组(均为P<0.05);干预组BALF和外周血中HMGB1、TLR4和IL-4含量均明显低于哮喘组,IFN-γ含量明显高于哮喘组(均为P<0.05)。BALF中HMGB1和TLR4含量分别与细胞总数和IL-4浓度均呈正相关(r1为0.796、0.730;r2为0.695、0.648;均为P<0.05)。结论 HMGB1和TLR4与气道炎症和免疫紊乱有关;适量1,25-(OH)2D3可减轻气道炎症,可能与调节Th1/Th2细胞平衡有关。     

基质细胞衍生因子在哮喘小鼠气道中的表达

目的 观察基质细胞衍生因子-1(stromal-derived factor-1, SDF-1)在鸡卵清蛋白(OVA)诱导小鼠哮喘模型中的表达,探索哮喘气道重塑的发生机制.方法 40只雌性SPF级C57BL/6小鼠,体重18～22g,随机分为哮喘组和对照组.按照文献方法建立OVA小鼠哮喘模型.两组动物于末次雾化结束后24h处死,取肺组织行病理切片,苏木精-伊红染色(HE)观察肺脏的组织病理学变化;逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、免疫印迹法(Western blot)、免疫组织化学(immunohistochemistry,IH)技术检测肺组织SDF-1的表达.结果 ①哮喘组支气管上皮细胞脱落、气道壁增厚,细支气管和血管周围有大量炎细胞浸润;②哮喘组肺组织SDF-1在RT-PCR、Western blot及IH中均为阳性表达,而对照组则否.结论 小鼠哮喘时肺组织分泌大量细胞趋化因子SDF-1,可能是哮喘气道重塑的重要因素之一.     

低氧诱导因子在肝肺综合征大鼠肺组织中的表达及其与糖调节蛋白78的关系

目的探讨低氧诱导因子-1α(HIF-1α)在大鼠肝肺综合征(HPS)发病中的作用及其与糖调节蛋白78(GRP78)的关系。方法复合致病因素法制备HPS大鼠模型。Western blotting法检测肺组织HIF-1α、血管内皮生长因子164(VEGF164)及GRP78蛋白表达水平。免疫组化染色法观察肺组织VEGF受体2(VEGFR-2)及CD105的表达。结果模型组动物肺组织HIF-1α蛋白表达水平在第8周显著高于同期正常对照组及4周、6周组;GRP78蛋白表达随病程进展逐渐升高,至第8周达到最高水平,各时间点之间以及与同期正常对照组比较差异均具有统计学意义;VEGF164蛋白表达随病程进展逐渐增加,至6周达到高峰,各时间点均显著高于同期正常对照组,6周和8周表达水平显著高于4周;VEGFR-2及CD105免疫组化染色强度和数量均随HPS进展逐渐增高;GRP78分别与VEGF164、VEGFR-2及CD105的表达水平呈正相关(P<0.05),HIF-1α与GRP78亦呈正相关关系(P<0.05)。结论 HIF-1α可能在HPS发病中起一定作用,与GRP78共同促进了肺微血管重构。     

上调miR-24对急性肺损伤幼龄大鼠炎症反应的影响及作用机制

目的探究微小型RNA-24(microRNA-24,miR-24)对急性肺损伤(acute lung injury,ALI)幼龄大鼠炎症反应的影响及作用机制。方法将幼龄大鼠分为Control、ALI、ALI+miR-24mimic mock及ALI+miR-24mimic组,利用脂多糖(LPS)建立幼龄大鼠ALI模型。miR-24mimic mock及ALI+miR-24mimic分别处理模型大鼠后,计算大鼠肺组织干湿重比,qRT-PCR检测miR-24的mRNA表达,HE染色观察大鼠肺组织病理变化,Tunel检测肺组织细胞凋亡情况,Western blot检测肺组织中磷酸化核因子κB p65(nuclear factorκB p65,NF-κB p65)、磷酸化核因子κB抑制蛋白(phosphorylation inhibitor of NF-κB,p-IκBα)及IκBα激酶(IκBαkinase,p-IKK)的表达。将大鼠肺泡巨噬细胞分为Control、LPS、LPS+miR-24mimic、LPS+pcDNA-IL-1α(pc-IL-1α)及LPS+miR-24mimic+pc-IL-1α组,利用LPS刺激细胞。miR-24mimic及pc-IL-1α分别或同时转染细胞后,qRT-PCR检测miR-24的mRNA水平,生物信息预测miR-24与IL-1α的靶向关系,并利用荧光素酶报告试验检测。ELISA检测肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-1α和IL-1β在各组幼龄大鼠血清中及各组大鼠肺泡巨噬细胞培养上清中的浓度。结果 miR-24在ALI幼龄大鼠肺组织的mRNA水平降低,miR-24mimic可上调miR-24mRNA表达。与Control组比较,ALI组幼龄大鼠肺泡内充满炎性细胞,肺干湿重比值增大,肺组织凋亡细胞百分比升高。与ALI组比较,ALI+miR-24mimic mock组无统计学差异,ALI+miR-24mimic组肺泡内炎性细胞明显减少,肺干湿重比值减小,凋亡细胞百分比降低。miR-24mimic可降低ALI幼龄大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β的浓度,减少肺组织中p-IKK、p-IκBα及NF-κB p65的表达。miR-24在经LPS处理大鼠肺泡巨噬细胞中的mRNA水平降低。miR-24mimic减弱野生型IL-1α质粒(IL-1αwt)的荧光素酶活性,并可降低经LPS处理大鼠肺泡巨噬细胞上清中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1α和IL-1β的浓度,而pc-IL-1α可提高这些炎症因子,并减弱miR-24mimic对炎症反应的抑制作用。结论 miR-24mimic可通过靶向IL-1α及抑制NF-κB激活,减轻ALI幼龄大鼠肺组织的炎症反应。     

IL-23/IL-17轴在反流性食管炎大鼠中的表达及其意义

目的 检测反流性食管炎大鼠食管黏膜IL-23p19、IL-17表达水平的变化,探讨IL-23/IL-17轴在反流性食管炎发病中的作用.方法 将30只SD大鼠随机分为3组:空白组、假手术组、模型组.通过半幽门结扎联合贲门肌切开术制备反流性食管炎模型,模型制备后,各组动物继续禁食24h(但不禁水),术后24 h给予进食,继续喂养4周后处死大鼠,HE染色法观察病理变化;实时荧光定量RT-PCR检测食管组织IL-23p19和IL-17的mRNA表达;ELISA法检测食管组织IL-17蛋白的含量.结果 4周后,与正常组比较,模趔组大鼠食管黏膜组织有不同程度的炎症表现.模型组食管组织IL-23p19、IL-17mRNA表达水平和IL-17蛋白的含量明显高于正常对照组、假手术组,后两者之间无统计学差异.结论 IL-23/IL-17轴是参与反流性食管炎发病的重要的细胞因子,可能参与了反流性食管炎的慢性炎症过程.     

苦参碱可抑制Th17所诱导的角质形成细胞IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的表达

目的考察苦参碱(matrine,Mat)对Th17诱导的角质形成细胞(keratinocytes,KC)系HaCaT细胞白细胞介素-17受体A(IL-17RA)、白细胞介素-21受体(IL-21R)及白细胞介素-22受体1(IL-22R1)表达的影响。方法培养HaCaT细胞,用Th17分泌的主要效应因子IL-17A(10ng/mL)、IL-21(10ng/mL)及IL-22(10ng/mL)联合刺激HaCaT细胞模拟类银屑病样细胞模型,再用10μg/mL及100μg/mL的Mat干预此细胞模型,采用RT-qPCR及Western blot方法检测IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的表达变化。结果 IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的mRNA及蛋白在HaCaT细胞上有表达。IL-17A、IL-21及IL-22联合刺激可以显著促进HaCaT细胞IL-17RA、IL-21RmRNA及蛋白表达,IL-22R1蛋白的表达量升高(P<0.05)。Mat单独干预或与上述细胞因子联合干预组与未处理的HaCaT细胞组相比,IL-17RA、IL-21R及IL-22R1表达无显著下降(P>0.05),但可以显著降低IL-17A、IL-21及IL-22联合刺激后所升高的受体蛋白表达(P<0.05)。结论 IL-17A、IL-21及IL-22联合刺激角质形成细胞可以增强IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的表达,Mat可抑制这种增强作用,可能在多种Th17介导的免疫性皮肤病中发挥抗炎作用。