TDI-FP法检测宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16、18型别感染

目的通过模板介导的染料终止子掺入-荧光偏振技术(TDI-FP)检测宫颈癌组织中人乳头瘤病毒(HPV)16、18感染情况,以初步探讨本地区HPV流行特点。方法基于TDI-FP的基本原理,以HPV16、18 L1克隆重组质粒为模板,用HPV通用引物GP5+/6+PCR扩增,再通过检测探针杂交后掺入的特异荧光素标记碱基的不同来判断病毒的类型。结果在宫颈癌组织中HPV16和18型阳性率分别为61.8%及32.7%,高危型HPV占宫颈癌HPV的98.1%,宫颈癌组高危型HPV阳性率显著高于癌前病变组和慢性宫颈炎组。结论初步提示宫颈癌患者HPV感染以高危型为主,其中有超过一半的患者以HPV16型感染为主。TDI-FP是一新兴的高通量基因检测技术,快速、可靠、敏感、特异并且操作简便,更适合于大规模临床筛查及在临床上广泛推广应用。     

宫颈癌患者人乳头瘤病毒16型E6基因的克隆及序列分析

目的　分析中国陕西地区宫颈癌患者人乳头瘤病毒 16型 (HPV16型 )E6基因的结构特点。方法　采用PCR技术扩增了 1例HPV16阳性宫颈癌患者癌组织中HPV16E6基因 ,并对其进行了克隆及全序列分析。结果　成功地克隆了HPV16E6基因 ,与GenBank收录的原型相比 ,E6基因中有 2个碱基发生突变 ,推导其编码的氨基酸有 1个发生了变化。结论　中国人宫颈癌HPV16E6基因结构有一定的变异     

TNFα基因-863位点单核苷酸多态性与宫颈癌以及HPV感染的关系

目的 探讨TNFα基因 863位点的单核苷酸多态性与宫颈癌以及HPV感染的关系.方法 采用模板介导的染料终止物掺入荧光偏振检测(TDI-FP)的方法对59例宫颈癌以及22例对照进行TNFα基因 863位点的单核苷酸多态性检测.结果 宫颈癌组的TNFα基因 863位点A等位基因频率(39.0%)较对照组(14.6%)明显升高(P<0.01,OR=2.673,95% CI:1.300～5.497);AA基因型在宫颈癌组和对照组中分别为15.3%和0,差异显著(P<0.05);CA基因型在两组中分别为47.5%和29.2%,差异显著(P<0.05);A等位基因频率在HPV阳性者与HPV阴性者之间没有显著性差异(P>0.05,OR=1.950,95% CI:0.840～4.527),但是在HPV阳性者中具有增高趋势(37.5%),高于HPV阴性者(19.2%).结论 TNFα基因 863位点A等位基因以及CA、AA基因型与宫颈癌的危险性升高有关,与HPV感染危险性无关.     

人宫颈癌FHIT基因的表达改变与HPV16感染的关系

目的探讨FHIT基因表达改变和HPV16感染与人宫颈癌发生的关系。方法采用反转录-巢式聚合酶链反应方法测定5种人宫颈癌细胞株(SiHa、HeLa、RJC-1、CS1213、C4-1)和58例宫颈癌组织与18例正常宫颈对照中FHIT mRNA的表达;回收7例FHIT基因不同的转录扩增产物,纯化后进行DNA测序;PCR技术检测组织中HPV16型的感染状况。结果SiHa、HeLa和C4-1宫颈癌细胞中有FHIT基因转录异常;宫颈癌组织中39例(67.2%)存在FHIT基因异常表达,显著高于正常对照组0例(0%)(P<0.05);37例(63.8%)有HPV16感染,显著高于正常对照组1例(5.0%)(P<0.05)。宫颈癌组织中有HPV16感染患者的FHIT基因表达异常数(30/37)显著高于HPV16未感染的患者(9/21),二者之间存在相关性(P<0.01);FHIT基因的异常表达和HPV16的感染与患者的年龄、临床分期、肿瘤直径、病理分级及是否伴淋巴结转移无相关性(P>0.05)。序列分析发现FHIT基因转录本主要存在不同程度的外显子的缺失,以第5位和第6位外显子的缺失为主,未见未知序列的插入和点突变。结论FHIT基因在人宫颈癌组织中的异常表达率明显增高,且与HPV16的感染有关,这些改变可能在人宫颈鳞癌的发生中起着重要作用。     

子宫颈癌患者HPV16 E6,E7血清抗体检测

通过基因工程技术制备HPV16 E6,E7抗原,用免疫酶联吸附法检测了44例子宫颈癌病人和20例健康献血员血清HPV16 E6,E7抗体。结果表明,健康人血清HPV16 E6和HPV16 E7抗体阳性者分别占35％(7/20)和20％(4/20)。病人血清中,HPV16 E6抗体阳性率68.18％(30/44),但其反应滴度均值与健康人无显著差异。HPV16 E7抗体阳性率为58.18％(25/44),其阳性率及反应滴度均明显高于健康人。这提示,HPV16 E6抗体可能并非HPV16的型特异性抗体,而HPV16 E7抗体则有可能成为子宫颈癌发生的预报信号。     

真核表达人乳头瘤病毒16型L_1蛋白在检测宫颈癌患者相应抗体的应用

用真核表达HPV16L1蛋白为抗原，酶联免疫吸附测定64例宫颈癌患者血清和阴道分泌物的相应抗体，并用型特异性聚合酶键反应检测宫颈癌组织HPV16L1基因。结果：宫颈癌组血清HPV16L1抗体阳性年64．1％，对照组20．8％；宫颈癌组阴道分泌物HPV16L1抗体阳性率64.1％，对照组25％；宫颈癌组HPV16L1基因检出率为42．2％，对照组10％。有显著差异（P＜0．01）。结论：高危型HPV感染，宫颈癌患者有明显免疫反应，全身和局部无明显差异，真核表达HPV16L1蛋白可用于宫颈癌患者的抗体测定。     

CD40基因多态性与自身免疫性甲状腺病的相关性

目的了解CD40基因多态性在西北地区汉族人群中的分布及其与自身免疫性甲状腺病(AITD)的相关性。方法随机选取本院内分泌科门诊的165例Graves病(GD)患者、113例桥本甲状腺炎(HT)患者为研究对象,以94例健康体查者为对照。①应用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性技术检测CD40基因5′非翻译区-1位点C/T多态性(5′UTR C(-1)T)、第三外显子58038位点-/T多态性;②应用扩增受阻突变系统-聚合酶链反应检测第九外显子64610位点C/G多态性。结果①5′UTR C(-1)T位点中CC基因型、C等位基因在GD组和对照组间有显著差异(P<0.05);②58038位点在372例样本中均为TT型;③64610位点未发现GG基因型。结论①西北地区汉族人CD40基因5′UTR C(-1)T位点上C等位基因型与GD发病有相关性,CC基因型者患GD的危险性较TT高;②58038位点-/T在西北地区汉族人中无多态性;③64610位点C/G在西北地区汉族人中未发现GG基因型。     

应用PCR技术克隆人乳头瘤病毒16型E6基因

为进一步研究与宫颈癌发生密切相关的人乳头瘤病毒16型E6基因的转化作用,我们运用PCR技术扩增HPV16 E6 DNA,以pUC—19为载体,大肠杆菌了JM103为宿主菌,组建了质粒pRCE6经限制性核酸内切酶和Southern转印杂交证实,其插入片段约为0.5Kb,含有全部HPV16 E6序列。该质粒的组建为检测HPV感染中mRNA转录提供了特异性的早期基因探针。同时为进一步研究HPV16 E6基因的转化作用及转化蛋白打下基础。     

子宫颈癌患者组织HPV16 E_6、E_7基因及其血清抗体检测

用多聚酶链反应检测子宫颈癌组织HPV16E6、E7基因，同时用基因工程方法制备E6、E7抗原，以免疫酶联吸附法检测其血清抗体。结果表明，宫颈癌组织中HPV16E6、E7DNA检出总阳性率为71．8％，E6、E7基因检出率分别为37．5％（12／32）和65．6％（21／32）。HPV16E6、E7血清抗体反应     

子宫颈癌患者组织HPV16 E_6、E_7基因及其血清抗体检测

用多聚酶链反应检测子宫颈癌组织HPV16E6、E7基因，同时用基因工程方法制备E6、E7抗原，以免疫酶联吸附法检测其血清抗体。结果表明，宫颈癌组织中HPV16E6、E7DNA检出总阳性率为71．8％，E6、E7基因检出率分别为37．5％（12／32）和65．6％（21／32）。HPV16E6、E7血清抗体反应阳性率为68．18％（30／44）和56．18％（25／44）。结果同时显示HPV16E6、E7DNA分布并不均一，存在E 6、E 7、E 6E 7和E6-E-74种模式，并且其血清抗体反应和DNA存在情况也不一致，E6抗体阳性的24例患者中，仅9例可检出其DNA，E，同样如此。这些似…     

人乳头瘤病毒16型(湖北株)E7蛋白在NIH/3T3细胞中的表达和定位

目的　将带有人乳头瘤病毒 1 6型 (湖北株 )E7基因的真核表达载体 pL(E7 HB)SN导入NIH/3T3细胞进行瞬时表达。方法　重组质粒转染 3T3细胞通过DNA 磷酸钙共沉淀法 ;E7基因表达的检测采用RT PCR和间接免疫荧光实验。结果　E7基因导入真核细胞后能有效转录并表达E7蛋白 ,通过免疫荧光染色可看到E7蛋白主要定位在胞浆中 ,细胞核中也有 ,但量较少。结论　这可能和湖北株HPV1 6E7基因发生突变有关。     

维吾尔族妇女宫颈癌组织中p16蛋白与HPV16/18的相关性

目的探讨在维吾尔族妇女宫颈癌组织中p16蛋白的表达和HPV(16/18型)感染的关系。方法采用免疫组化S-P法和聚合酶链反应(PCR)技术检测34例正常宫颈组织(汉族19例,维吾尔族15例)以及40例宫颈癌组织(汉族18例,维吾尔族22例)中p16蛋白的表达和HPV16/18的感染情况。结果维吾尔族宫颈癌及正常宫颈组织中p16蛋白的阳性表达率与汉族相比均无统计学差异(P>0.05);维吾尔族、汉族宫颈癌中p16蛋白的阳性表达率(97.50%)明显高于维吾尔族、汉族正常宫颈组织(2.94%)(P<0.05)。HPV16型感染的宫颈癌中维吾尔族阳性表达率(54.54%)高于汉族(22.22%)(P<0.05);但HPV18型感染的宫颈癌无统计学意义(P>0.05)。维、汉宫颈癌组织中p16蛋白表达量与HPV16型感染的相对表达量呈显著正相关性(r=0.603,P<0.05)。结论p16蛋白和HPV联合检测可能作为检查宫颈癌的标记物,提高宫颈癌的检出率。     

人乳头瘤病毒16型转化基因的筛选及次级克隆

人乳头瘤病毒16型转化作用在宫颈癌发生中可能起重要作用,其转化基因主要位于基因组早期区域E6、E7开放阅读框架内。为了进一步研究HPV16转化作用,我们以Pstl+ECoRI酶解HPV16DNA,以pUC-19为载体,大肠杆菌JM103细胞为宿主菌,经两次定向次级克隆,组建了质粒pEP-8。经限制性核酸內切酶和Southem转印杂交证实,其插入片段为-1.43Kb带有E6、E7 ORF的DNA片段。在E6区上游序列还含有两个TATA盒,1个Cat盒和1个细胞特异性增强子。该质粒的组建为检测HPV感染细胞中mRNA转录提供了特异性的早期基因探针,同时为进一步研究HPV转化作用及转化蛋白打下了基础。     

胃癌hPOT1基因单核苷酸多态性与幽门螺杆菌感染的关系

目的探讨胃癌中人端粒保护蛋白1基因(hPOT1)IVS13-98G/T位点单核苷酸多态性与幽门螺杆菌(H.pylori)感染的关系。方法采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)对150例外科手术切除的胃癌患者和156例正常对照者行基因型分析,采用PCR和Warthin-Starry银染色法检测幽门螺杆菌。结果胃癌组hPOT1IVS13-98 T/G位点GG、GT、TT基因型的频率分别22.00%、41.67%、36.67%,G、T等位基因频率分别为42.67%、57.33%;对照组GG、GT、TT基因型的频率分别为24.36%、51.92%、23.72%,G、T等位基因频率分别为49.68%和50.32%。两组G、T等位基因型频率比较无统计学意义(2χ=3.0257,P=0.0820)。以T/T基因型作为参照基因型,G/T和G/G两种基因型OR值分别为0.432(95%CI:0.242-0.772,P=0.005)、0.540(95%CI:0.274-1.064,P=0.075)。胃癌中3种基因型H.pylori的检出率无统计学意义(P>0.05)。结论hPOT1 IVS13-98G/T单核苷酸多态性可能与甘肃胃癌高发区的胃癌患者有关,可能为胃癌的保护因素。胃癌hPOT1 IVS13-98G/T单核苷酸多态性与H.pylori感染无关。     

ABCB1基因多态性对乳腺癌紫杉类药物化疗疗效的影响

目的检测乳腺癌患者多药耐药(ABCB1/MDR1)基因多态性,分析其与乳腺癌患者应用紫杉类药物化疗疗效的关系。方法采用PCR-HRM技术检测146例Ⅳ期乳腺癌患者ABCB1exon12(C1236T)、exon21(G2677T/A)和exon26(C3435T)基因分型,探讨其与乳腺癌患者应用紫杉类药物化疗疗效的关系。结果 146例Ⅳ期乳腺癌患者中,C1236T位点CC基因型占15.86%,CT基因型占44.83%,TT基因型占39.31%;G2677T/A位点GG基因型占16.67%,GT基因型占45.83%,GA基因型占6.25%,TT基因型占28.47%,AT基因型占2.78%;C3435T位点CC基因型占22.22%,CT基因型占56.25%,TT基因型占21.53%。回族与汉族病例组中ABCB1待测位点基因多态性相比,差异无统计学意义(P>0.05)。经Hardy-Weinberg遗传平衡检验,认为C1236T、G2677T/A和C3435T基因多态性具有群体代表性(P>0.05)。146例Ⅳ期乳腺癌患者接受以紫杉为基础的化疗方案,C3435T位点CT/TT基因型患者有74.11%较好的反应率(χ2=12.556,P<0.05),化疗疗效优于CC基因型(OR=4.183,95%CI 1.838~9.521,P<0.05),T等位基因携带者化疗有效率高于C等位基因携带者(χ2=8.507,P<0.05)。结论检测ABCB1基因C3435T位点基因多态性对预测乳腺癌患者应用紫杉类药物化疗疗效有重要的临床参考价值。     

女性外阴病变及其与HPV16/18、HPV6的相关性

目的研究外阴病变及其与HPV16/18、HPV6的关系。方法收集西安交通大学医学院第二附属医院手术治疗的44例女性外阴病变患者的临床病理资料,包括鳞癌11例,鳞状上皮内瘤变(VIN)10例,尖锐湿疣9例及白色病变14例。采用免疫组化SP方法检测HPV16/18E6蛋白、HPV6L1蛋白的表达。结果①4组外阴病变患者年龄中位数依次为:外阴鳞癌61岁、VIN 45.5岁、尖锐湿疣24岁、外阴白色病44岁,尖锐湿疣组中位年龄低于外阴鳞癌组及白色病变组(P<0.05),其余各组间中位年龄无统计学差异。②HPV16/18E6蛋白在外阴白色病变组、尖锐湿疣组、VIN组及外阴鳞癌组的阳性率分别为2/14、3/9、3/10、8/11,外阴鳞癌组高于白色病变组(P<0.05),其余各组间无统计学差异;HPV6L1蛋白在外阴白色病变组、尖锐湿疣组、VIN组、外阴鳞癌组的阳性率分别为1/14、8/9、4/10、3/11,尖锐湿疣组高于其他各外阴病变组(P<0.05),其余各组间比较差异无统计学意义。③HPV16/18E6蛋白、HPV6L1蛋白在早期外阴鳞癌的阳性率均高于中晚期(P<0.05);HPV16/18E6蛋白、HPV6L1蛋白表达均与外阴鳞癌的组织学分级、年龄分组、绝经情况、产次不相关(P>0.05);HPV16/18E6蛋白与HPV6L1蛋白在外阴鳞癌中的表达不相关(P>0.05)。结论外阴病变的发病与年龄及HPV16/18、HPV6感染有关;外阴鳞癌中HPV16/18、HPV6的感染率与FIGO分期有关,HPV16/18感染率与HPV6的感染率无关。     

β2肾上腺素能受体基因多态性与维吾尔族肥胖的关系

目的探讨β2肾上腺素能受体(β2-adrenergic receptor,β2-AR or ADRB2)基因R16G、Q27E多态性与新疆维吾尔族人群肥胖发生的相关性。方法采用Taqman技术对新疆754例维吾尔族受试者进行β2-AR基因R16G、Q27E位点基因分型,并分析各基因型和等位基因频率在不同体重指数(BMI)水平的分布及其与超重、肥胖的关系。结果维吾尔族人群中超重组与肥胖组的血压、甘油三酯及胆固醇水平显著高于正常体重组(P<0.05)。R16G、Q27E两个多态位点的基因型频率与等位基因频率在正常体重组、超重组与肥胖组之间的分布均无统计学差异(P>0.05);按性别分层后基因型与等位基因频率的分布在3组间亦未见统计学差异。R16G、Q27E多态构成的4种单倍型在正常体重组、超重组与肥胖组的分布无统计学差异(P>0.05)。维吾尔族与汉族人群间比较,Q27E基因型与等位基因频率分布的差异有统计学意义(P<0.001)。结论β2-AR基因R16G、Q27E多态性与新疆维吾尔族人群肥胖发生无关,但Q27E基因型与等位基因频率分布在汉族与维吾尔族人群间不同。     

宫颈上皮内瘤变及微浸润癌患者人乳头瘤病毒基因亚型分析

目的明确陕西省宫颈上皮内瘤变(CIN)及微浸润癌(MICC)病例宫颈人乳头瘤病毒(HPV)感染的基因亚型分布特征。方法选取2009年10月至2015年10月在西安交通大学第一附属医院病理确诊的1 571例陕西地区宫颈病变患者,其中CIN 1、CIN 2、CIN 3、原位癌(CIS)、MICC分别为252、505、539、143、132例,采用凯普医用核酸分子快速导流杂交基因芯片技术检测宫颈样本中高危型HPV(HR-HPV)15种和低危型HPV(LR-HPV)6种(共21种)HPV基因亚型,分析HPV基因分型检测结果。结果总体HPV感染率为90.64%。HR-HPV感染率89.37%,占HPV阳性标本的98.60%;总体HPV感染率和HR-HPV感染率在CIN 1、CIN 2、CIN 3、CIS、MICC中分别为76.98%和73.02%、89.70%和88.51%、95.73%和94.99%、95.80%和95.80%、93.94%和93.94%,各组间差异除CIN3+(即CIN3和CIS)与MICC组外均有统计学意义(χ~2=18.11~136.96,P<0.001)。感染率最高者为HPV16(55.63%),其他常见亚型为HPV58(16.74%)、52(11.01%)、33(7.00%)、31(6.62%)、18(5.86%)。LR-HPV感染率6.68%。LR-HPV感染率在前述各组中分别为10.32%、8.32%、4.64%、3.50%、5.30%。常见LR-HPV为HPV81(2.93%)、11(1.78%)、6(1.21%)。高危/低危HPV混合感染率5.41%。CIN1组HPV基因亚型分布特征明显不同于其他病变组。结论陕西地区宫颈病变中HPV感染水平符合疾病本质规律且随着病变加重显著增加,其基因型分布基本符合亚洲人群分布规律并具一定区域性差异。HPV基因亚型分布特征在不同病变中的差异反映了不同亚型在宫颈病变发生中作用的不同。本结果对理解宫颈病变的发生机制、宫颈癌防治和疫苗研制具有指导意义。     

妇科门诊患者宫颈人乳头瘤病毒的感染情况分析

目的 探讨妇科门诊就诊患者宫颈感染人乳头瘤病毒(HPV)基因型的特点.方法 选择2009年11月～2011年11月西安交通大学医学院第一附属医院妇科门诊就诊的来自西安或其周边地区、有性生活史并要求行宫颈病变筛查者2 641例,对其HPV感染状况、各病毒亚型感染情况及各个年龄段HPV感染状况进行分析.结果 妇科门诊就诊患者中HPV感染率较高,约37.15％.其中大部分为HPV高危型感染,占HPV感染的68.4％; HPV低危占10.5％;中国人常见亚型占6.73％.HPV高危型、HPV低危型、HPV中国人常见亚型之中任意两种或三种HPV亚型共同感染(混合感染)占HPV感染的14.37％.其中HPV16、HPV58、HPV52为高危型HPV感染主要型别,HPV6和HPV11为低危型HPV感染主要型别;未发现HPV43型感染病例.HPV各型的感染率与年龄有一定的关系.其中HPV高危型感染随年龄增长呈上升趋势,在18～30岁年龄段感染率最低,约21.7％;60岁以上年龄段达到顶峰,约30.56％.HPV低危型感染在18～30岁及60岁以上两个年龄段感染率相对高,其余年龄段感染率较低.结论 西安地区就诊患者HPV感染率较高(37.15％).高危型HPV、低危型HPV感染在不同年龄段的感染率有显著差异.     

基于家系的腰椎间盘突出症患者强效基因筛选策略

目的对一个椎间盘退变疾病高发家系中4名椎间盘突出患者进行外显子基因测序,寻找此家系中可能导致椎间盘退变的强效致病基因,为研究椎间盘疾病的发病原因以及致病机制提供可能的帮助。方法收集西安交通大学第一附属医院、西安医学院第一附属医院、西安唐城医院自2010年1月至2016年12月之间就诊的腰椎间盘突出患者,对其进行详细的病史采集及家系调查,从中找到椎间盘退变疾病高发的1个家系。在此家系中,20～50岁成员中有4人为腰椎间盘突出症患者。利用外显子测序技术对这4例患者进行外显子基因分析,检测4例患者的共同外显子突变位点。结果最终在4个样本中检测出IGFBP6的共同突变Chr12:g.53494591T>C。Sanger法对其进行家系内验证,IGFBP6在4例患者中皆表现为C/T型,而在5例正常对照者中皆表现为T型。最后在正常对照组200例中进行验证,未发现此位点变异。结论 IGFBP6的突变位点c.T430C(p.S144P)(Chr12:g.53494591T>C)可能是导致该家系中椎间盘突出疾病高发的因素;外显子测序技术可以应用于复杂疾病致病基因的发掘。