分子印迹技术及其在药物分离与分析中的应用

复杂体系微量药物和药物相关物质的分离与分析是药学研究领域的共性问题。建立高灵敏度、高选择性、高速度、自动化、连续化、智能化的分析技术是药物分析学科发展的重要方向。新方法的建立对于进一步了解生命过程和药物的作用、保障药品质量、提高药品疗效发挥了积极的推动作用。近年来发展起来的分子印迹技术具有构效预定性、识别特异性、长期稳定性和广泛适用性等特点,得到研究者的广泛关注。本文简述分子印迹技术的原理和制备方法,综述了分子印迹技术在手性药物分析、体内药物分析、中药活性成分和生物大分子的分离与分析等中的应用,并对其面临的问题及应用前景进行了展望。     

基于鸟枪法蛋白质组学和生物信息学技术对肺鳞癌表达蛋白质谱的分析

目的应用高通量蛋白质组学及生物信息学技术分析肺鳞癌表达蛋白质谱,筛选肺癌标志蛋白质,为肺鳞癌发病机制、早期诊断及治疗提供有价值的线索。方法 6例手术后新鲜肺鳞癌组织,通过激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)分离纯化肿瘤细胞并提取可溶性总蛋白;多维液相色谱-离子阱串联质谱技术(也称鸟枪法蛋白质组学,shot gun proteomics)对蛋白质进行分离、鉴定;进一步通过生物信息学工具预测肺鳞癌细胞表达蛋白质的理化性质、分子功能、生物通路及蛋白质相互作用,并筛选潜在的标志蛋白。结果 LCM共收集了60个帽(cap)的感兴趣细胞,平均每个LCM cap捕获感兴趣细胞数约12000个,其同质性大于95%。可溶性总蛋白经多维液相色谱-离子阱串联质谱共鉴定出860个非冗余蛋白质。蛋白质的理化性质包括分子量、等电点、平均疏水性、跨膜结构域、亚细胞定位、转录后修饰和组织分布等经过在线生物信息学工具分析,并通过统计图直观显示;蛋白质生物学功能基于Gene Ontologyc(GO)软件和Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)生物学通路分析,根据其注解,筛选出3个有价值的蛋白质,即分裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、粘联素A1(annexin A1,ANXA1)、高移动组蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGPB1)可以作为肺鳞癌候选的标志蛋白。结论鸟枪法蛋白质组学可大规模分离、鉴定肿瘤细胞表达蛋白质,基于生物信息学筛选的标志蛋白质可能成为肺癌诊断和治疗的分子靶点。     

疏水色谱分离人腮腺液蛋白影响因素初探

初步建立了一种分离纯化人腮腺液蛋白的方法。探讨了样品的预处理、不同固定相、流动相以及不同检测波长等因素对正常人腮腺液蛋白疏水色谱分离的影响。结果在４０ｍｉｎ梯度内，以２ｍｏｌ／Ｌ硫酸铵为Ａ流动相，以０．０５ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钾为Ｂ流动相（１００％Ａ∶０％５～０％Ａ∶１００％Ｂ），腮腺液蛋白被分离出６个峰。经生化方法证实，用疏水色谱分离人唾液蛋白的方法，分离度好，保持了蛋白样品的生物活性，且样品处理简单，可成为研究人唾液蛋白成分的一种较理想的方法。     

氟喹诺酮类抗菌药物司帕沙星

司帕沙星（sparfloxacin,Spar)是一种具有广谱抗菌活性的氟喹诺酮类抗菌药物。在保留了对革半阴性菌的抗菌活性之外，司帕沙星对革半阳性菌及厌氧菌也有一定作用，其抗菌活性增强，并具有口服吸收良好，组织分布广，生物利用度高，每日只需给药一次等特点。１９９３年司帕沙星首先在日本上市，继而在法国、英国、比利时、芬兰及瑞士等多国注册。现我国已有上市，为浙江海正药业股份有限公司生产的海正立特，本文对其抗菌活性、药代动力学特征、临床应用及与其他药物的相互作用综述如下。     

用血管内皮细胞膜色谱模型研究9种药物的生物亲和作用

目的 增加细胞膜色谱法的适用范围,构建血管内皮细胞细胞膜固定相,研究药物与血管内皮细胞膜上受体的生物亲和作用.方法 培养血管内皮细胞细胞株,制备细胞膜固定相,应用细胞膜色谱法研究九种药物与受体的亲和力.结果 九种不同的配体与受体的亲和顺序为:S(+)QNB、哌唑嗪、R(-)QNB、阿托品、育亨宾、BMY7378、(±)美托洛尔、山莨菪碱、东莨菪碱.其容量因子分别为:14.289、13.667、11.121、6.794、4.758、4.386、3.926、2.424、2.412.结论 血管内皮细胞膜色谱模型具有高度稳定性,可试用于药物的高效初筛.     

Twist表达增强乳腺癌MCF-7细胞的多药耐药性

目的探讨MCF-7/Twist稳定表达细胞株的多药耐药性。方法 MCF-7细胞中转染Twist,G418筛选,建立稳定表达细胞株MCF-7/Twist,Western blotting法检测Twist表达;观察增殖状态;MTT法测阿霉素、紫杉醇、长春新碱和羟喜树碱对细胞株增殖活性的影响,分析稳定转染细胞株对药物的敏感性;应用RT-PCR及Western blotting方法,检测耐药相关糖蛋白P-gp和乳腺癌耐药蛋白BCRP转录水平和蛋白水平的变化。结果 G418筛选获得稳定表达Twist的细胞株,对阿霉素、紫杉醇、长春新碱和羟喜树碱具有明显耐药性,耐药相关分子P-gp和BCRP转录和表达明显升高。结论 Twist表达增强乳腺癌细胞的多药耐药性,多药耐药性相关分子的转录和表达升高与耐药性增强现象一致。     

靶向巨噬细胞膜蛋白Vsig4特异性纳米抗体的构建和筛选

目的构建V-set and immunoglobulin domain containing 4(Vsig4)特异性纳米抗体,以期作为巨噬细胞的分子探针。方法用Vsig4重组蛋白对羊驼进行免疫,分离血液中的淋巴细胞,利用噬菌体展示技术,构建噬菌体展示文库,经过连续3次生物淘筛获得与Vsig4蛋白结合的噬菌体,经测序和基因比对所得VHH序列,用ELISA法筛选出抗Vsig4的高亲和力纳米抗体,并用Vsig4稳定表达细胞系验证纳米抗体的结合能力。结果成功构建了插入率为70%、库容量为7.27×107的噬菌体表达文库,经过克隆筛选获得136个Vsig4阳性单克隆,经测序获得15个不同的VHH基因,将这些基因克隆至原核表达体系,表达和纯化后获得了高纯度的Vsig4纳米抗体,其中Nb119的亲和力最高,并且可以与Vsig4稳定表达细胞系结合。结论成功构建并筛选了特异性、高亲和力的Vsig4纳米抗体,以期用于检测巨噬细胞表面Vsig4的表达和构建特异性分子探针。     

抗人精浆蛋白单链抗体基因在HeLa细胞中的表达和活性鉴定

目的　在HeLa细胞中表达抗人γ 精浆蛋白 (γ Sm)单链抗体 (scFv)基因 ,并进行亲和活性测定。方法　在已经构建抗人γ SmscFv基因基础上 ,将基因克隆入真核分泌表达载体 pSecTag2 B中 ,并转染HeLa细胞进行表达。表达产物纯化后 ,用流式细胞仪进行亲和活性测定。结果　表达产物经SDS PAGE和Western印迹实验证实为约30ku的特异蛋白条带 ,纯化后经流式细胞仪检测可以特异性地结合PC 3细胞。结论　获得了可与PC 3细胞特异结合的抗人γ SmscFv ,为进一步临床应用奠定基础     

人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞7702的差异蛋白质组学研究

目的应用蛋白质组学技术探讨人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞7702的蛋白质差异表达谱,筛选肝细胞癌的特异性标志物。方法应用双向电泳(2-DE)方法对细胞总蛋白进行分离和分析,用质谱(MS)鉴定差异表达蛋白,并用免疫组化方法验证部分差异表达蛋白。结果与7702细胞相比,在HepG2细胞中鉴定出17种差异表达蛋白,10种上调,7种下调,主要涉及物质代谢酶和抗凋亡、调节应激和细胞间信号传导的蛋白质;免疫组化结果验证了膜联蛋白A1(annexin A1)和亲环蛋白A(cyclophilin A)在肝细胞癌病理组织中均明显上调,且主要定位于胞质内。结论人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞7702的蛋白质表达差异显著,其中膜联蛋白A1和亲环蛋白A可作为肝细胞癌诊断及治疗的分子标志物。     

小细胞肺癌及其配对的正常肺组织差异表达蛋白质的双相电泳-飞行时间质谱研究

目的应用比较蛋白质组学方法分析小细胞肺癌(SCLC)与其配对的正常肺组织差异表达蛋白质,为阐明SCLC发病机制、筛选其早期诊断标志物提供有益的思路。方法应用双相电泳(2-DE)分离6例SCLC及其配对的正常肺组织可溶性总蛋白;应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)获得差异蛋白点的肽质量指纹图谱(PMF);通过Mascot软件查询NCBI或SWISS-PROT数据库鉴定蛋白质。结果每张图谱约检测到800多个蛋白质点。经匹配分析,肺癌组织之间和正常肺组织之间凝胶图像的匹配率分别为75.5%和78.2%;选择14个背景清晰、重复性及分辨率较好、蛋白表达差异明显的点进行质谱分析,结合表观分子量及等电点(pI),初步鉴定了11种(六类)蛋白质:①与蛋白质降解通路有关的蛋白质:蛋白酶体α亚单位3型、蛋白酶体β亚单位2型及β亚单位5型;②自由基/抗氧化剂类:锰-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)和黄素还原酶(FR);③细胞骨架类:原肌球蛋白-3(Tpm-3);④与能量代谢有关的蛋白质:硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX1);⑤分子伴侣:抑制素(PHB),内质网蛋白ER29(Erp29);⑥其他:可溶性NSF黏附蛋白(alpha SNAP)。结论应用2-DE及MALDI-TOF-MS方法分离并初步鉴定了11种(六类)蛋白质;这些蛋白质与SCLC发生发展密切相关,部分可能成为SCLC诊断及治疗的分子靶点。